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2015 年度 実績報告書

SPring-8オンライン赤外分光光度計の開発とバイオ活性サイトの反応過渡種計測

公募研究

研究領域3D活性サイト科学
研究課題/領域番号 15H01055
研究機関国立研究開発法人理化学研究所

研究代表者

久保 稔  国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (90392878)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2017-03-31
キーワード赤外分光 / 超精密計測 / X線結晶構造解析 / 生体分子 / 高性能レーザー / 生物物理
研究実績の概要

本研究の目的は、赤外レーザーや赤外放射光といった高輝度赤外光源を用いて、タンパク質微結晶(結晶サイズ100 μm以下)に適用可能な高感度顕微赤外分光技術を開発し、赤外分光とX線結晶構造解析との相補利用を促進することである。最終的にはX線結晶構造解析のビームラインでのon-line分光計測を目指す。X線結晶構造解析において、同一試料のon-line分光計測は、試料状態の評価、特にX線損傷の評価や反応中間体の同定などに有用である。本研究では、一酸化窒素還元酵素(NOR)の中間体の解析を通して、X線結晶構造解析ならびに赤外分光の技術開発・相補利用を進める。NORは、微生物の嫌気呼吸を担っており、細胞毒であるNOをN2Oにまで還元するヘム酵素である。
本年度は、on-line赤外分光装置のベースとなるon-line可視分光装置を完成させた。赤外分光への発展を念頭に、装置は全て反射光学系で構築した。装置は、SPring-8構造ゲノミクスビームライン(BL26B2)に設置し、カビ由来NOR結晶(NO結合型)のX線損傷の評価に応用した。X線照射下でヘムの可視吸収スペクトルを実時間でモニターした結果、わずかsub-MGyのX線吸収線量でヘムが損傷される様子が観測された(J. Synchrotron Rad. 2016)。無損傷のX線結晶構造解析を行なうためにはSACLAのフェムト秒X線を用いる必要があるため、今後はSACLAでのon-line分光計測も視野に入れる必要がある。
また、SPring-8 BL43IRにおいて、カビ由来NOR結晶(NO結合型)の赤外分光測定を行なった。テーパー型赤外フローセルを開発し、結晶を常温・母液環境下で安定にマウントした。まずは100 μm以上の大型結晶を用いて、NO伸縮振動(1855 cm-1)の観測に成功したところである。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

on-line赤外分光装置のベースとなるon-line可視分光装置を開発し、NORへの応用例とともに、誌上発表できたため

今後の研究の推進方策

on-line可視分光装置をベースに、on-line赤外分光の計測系を開発する。赤外光源としては、軽量で持ち運び可能な量子カスケードレーザーを用いる予定である。
また、高輝度赤外光源である赤外放射光(SPring-8/BL43IR)を利用したタンパク質微結晶の赤外分光も推進する。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2016 2015

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (6件) (うち国際学会 3件、 招待講演 1件)

  • [雑誌論文] A nearly on-axis spectroscopic system for simultaneously measuring UV-visible absorption and X-ray diffraction in the SPring-8 structural genomics beamline2016

    • 著者名/発表者名
      M. Sakaguchi, T. Kimura, T. Nishida, T. Tosha, H. Sugimoto, Y. Yamaguchi, S. Yanagisawa, G. Ueno, H. Murakami, H. Ago, M. Yamamoto, T. Ogura, Y. Shiro, M. Kubo
    • 雑誌名

      J. Synchrotron Rad.

      巻: 23 ページ: 334-338

    • DOI

      10.1107/S1600577515018275

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Time-resolved SFX at SACLA and its application to bacteriorhodopsin photocycle2016

    • 著者名/発表者名
      M. Kubo
    • 学会等名
      The 2nd SACLA Workshop on Structural Biology with FELs "Update on some recent time-resolved experiments performed at SACLA & LCLS"
    • 発表場所
      理化学研究所・SPring-8(兵庫県佐用郡)
    • 年月日
      2016-02-02 – 2016-02-02
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] X線自由電子レーザーを用いた脱窒カビ由来NO還元酵素基質結合型の無損傷結晶構造解析2015

    • 著者名/発表者名
      西田拓真,當舎武彦,杉本宏,木村哲就,平田邦夫,上野剛,吾郷日出夫,山本雅貴,城宜嗣,久保稔
    • 学会等名
      第88回日本生化学会大会
    • 発表場所
      神戸ポートアイランド(兵庫県神戸市)
    • 年月日
      2015-12-03 – 2015-12-03
  • [学会発表] SACLAを用いた脱窒カビ由来NO還元酵素の基質結合型無損傷X線結晶構造解析2015

    • 著者名/発表者名
      西田拓真,當舎武彦,杉本宏,木村哲就,平田邦夫,上野剛,吾郷日出夫,山本雅貴,城宜嗣,久保稔
    • 学会等名
      平成27年度日本結晶学会年会
    • 発表場所
      大阪府立大学(大阪府堺市)
    • 年月日
      2015-10-17 – 2015-10-18
  • [学会発表] Development of on-axis simultaneous measurement system of UV-visible absorption with X-ray diffraction at SPring-82015

    • 著者名/発表者名
      Sakaguchi, M., Kimura, T., Nishida, T., Tosha, T., Yanagisawa, S., Ueno, G., Murakami, H., Ago, H., Yamamoto, M., Ogura, T., Shiro, Y., ○Kubo, M.
    • 学会等名
      12th International Conference on Synchrotron Radiation Instrumentation (SRI 2015)
    • 発表場所
      Marriott Marquis Times Square (New York, USA)
    • 年月日
      2015-07-08 – 2015-07-08
    • 国際学会
  • [学会発表] ケージドNOを用いた脱窒カビ由来NO還元酵素結晶における反応中間体の調製2015

    • 著者名/発表者名
      西田拓真,當舎武彦,坂口美幸,木村哲就,柳澤幸子,上野剛,村上博則,山本雅貴,小倉尚志,城宜嗣,久保稔
    • 学会等名
      第15回日本蛋白質科学会年会
    • 発表場所
      あわぎんホール(徳島県徳島市)
    • 年月日
      2015-06-25 – 2015-06-25
  • [学会発表] Damage-free X-ray crystallographic analysis of P450nor in the NO bound form using SACLA2015

    • 著者名/発表者名
      Nishida, T., Tosha, T., Sugimoto, H., Kimura, T., Hirata, K., Ueno, G., Ago, H., Yamamoto, M., Shiro, Y., Kubo, M.
    • 学会等名
      Metals in Biology in Wako
    • 発表場所
      理化学研究所・和光(埼玉県和光市)
    • 年月日
      2015-06-16 – 2015-06-17
    • 国際学会

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公開日: 2017-01-06  

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