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FBXL3とFBXL21は互いに最も近縁なF-box型E3リガーゼであるが、時計タンパク質CRYの分解促進と安定化という拮抗的な作用を示す。Fbxl3欠損マウスは行動リズム周期が約28時間と野生型に比べて顕著に長くなる一方で、Fbxl3とFbxl21との二重欠損マウスは恒暗条件で飼育すると徐々にリズム性を失う。このリズム性消失の原因を追究するため、本研究では二重欠損マウスから時計中枢である視交叉上核を単離し、高感度CCDカメラを用いて個々の細胞の生物リズムを連続測定した。この実験には、視交叉上核の各細胞の時計振動を可視化するために、PER2タンパク質とルシフェラーゼとを融合したノックインマウスを利用した。その結果、各ニューロンのロバストなリズムが脱同調しているというよりも、個々のニューロンの細胞リズムが顕著に減弱していることを見出した。このことから、FBXL3とFBXL21のCRYに対する拮抗的な作用は、1細胞レベルでの時計機能の維持に必須であると考えられた。
一方、時計関連転写因子であるDBPは著しい日内変動リズムを示し、時計機構の時刻シグナルをスイッチのようにオン・オフで切り替えることができる出力因子である。我々は、RNA-SeqやqRT-PCR法を用いてmRNAの著しいリズム性を確認し、特異的抗体を自作することにより、DBPタンパク質の顕著な日周変動も確認した。さらにChIP-Seq解析を行い、DBPのゲノムワイドな転写出力とそのリズムを明らかにした。また質量分析により、DBPのリン酸化部位とユビキチン化部位を決定すると共に、その相互作用分子を複数同定した。一方、DBPタンパク質はプロテアソームの阻害によって安定化することを示し、このDBP分解に関与するE2タンパク質とE3リガーゼの候補を絞り込んだ。
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