| 研究実績の概要 |
Inflammasomes are cytosolic multimolecular protein complexes that stimulate the activation of caspase-1 and the release of mature forms of interleukin-1β (IL-1β) and IL-18. We previously demonstrated that the influenza A virus M2 protein stimulates IL-1β secretion following activation of the nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome. The nonstructural protein 1 (NS1) of influenza virus inhibits caspase-1 activation and IL-1β secretion. However, the precise mechanism by which NS1 inhibits IL-1β secretion remains unknown. Here, we showed that J774A.1 macrophages stably expressing the NS1 protein inhibited IL-1β secretion after infection with recombinant influenza virus lacking the NS1 gene. Coimmunoprecipitation assay revealed that the NS1 protein interacts with NLRP3. Importantly, the NS1 protein inhibited the NLRP3/ASC-induced single-speck formation required for full activation of inflammasomes. The NS1 protein of other influenza virus strains, including a recent pandemic strain, also inhibited inflammasome-mediated IL-1β secretion. The NS1 RNA-binding domain (basic residues 38 and 41) and TRIM25-binding domain (acidic residues 96 and 97) were required for suppression of NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β secretion. These results shed light on a mechanism by which the NS1 protein of influenza virus suppresses NLRP3 inflammasome-mediated IL-1β secretion.
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| 今後の研究の推進方策 |
SARSコロナウイルス3a, E遺伝子（これらはviroporinとして機能することが知られていて、核遺伝子を発現するプラスミドは、National Taiwan UniversityのChang Ming-Fu教授より分与いただいた）をレンチウイルスベクターに組込み（ViraPower Lentiviral Expression Systems, Invitrogen）、SARSコロナウイルス3a, Eタンパク質を発現する組換えレンチウイルスを作製する。これをマウスマクロファージに感染させ（コントロールにはEGFPを発現するレンチウイルスを使用する）、培養上清中のIL-1βの産生をELISAで、caspase-1の活性化をウェスタンブロット法（W.B.）により確認する。各ウイルスタンパク質の細胞内局在は、V5タグ抗体を用いて共焦点顕微鏡により観察する。またSARSコロナウイルス、またはSARSコロナウイルス感染細胞からRNAを抽出し、ウイルスRNAをマウスマクロファージにトランスフェクションしたときの、インターフェロンβのmRNA量を定量PCR法で、培養上清中のIL-1βの産生をELISAで測定する。3a, Eタンパク質のどちらかまたは両者がIL-1βの産生に関わっている場合、これらviroporinの何がIL-1βの産生に関わっているのかを解析する。具体的には、細胞内カルシウム濃度の変化や、ER/Golgi内のカルシウム濃度の低下をこれまでと同様の方法により解析する。また培養液中に高濃度（130mM）のKCl存在下による、3a, Eタンパク質によるNLRP3 inflamamsomeの活性化とIL-1βの産生を解析し、これらviroporinによるNLRP3 inflammasomeの活性化がpotassium efflux依存的かどうか確かめる。さらにNLRP3, ASC, caspase-1ノックダウンJ774A.1細胞にSARSコロナウイルスを感染させて、SARSコロナウイルス感染によるIL-1βの産生がNLRP3 inflammasome依存的かどうか確かめる。
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