|
細胞活動に重要なアクチンフィラメントの内部構造の変化を単分子レベルで捉えることを目指し、FRETの偏光依存性を利用した計測法（偏光FRET法）の開発を進めている。偏光FRET法であれば、たとえ溶液中を回転拡散している生体分子であっても、その内部構造の変化（主に角度変化）を高感度で捉えられる。この偏光FRET法を実現するためにはタンパク質の部位特異的に修飾するためにシステイン反応性のmaleimide基を持つbifunctional dyeが必要となる。そこで市販されているCy3-bis-NHSおよびCy5-bis-NHSを改変し、２つのmaleimide基を持つCy3-bis-maleimideおよびCy5-bis-maleimideを合成した。次に、これら合成した２種類のbifunctional dyeをアクチンへ部位特異的に修飾するために４箇所のシステイン変異を導入したテトラシステイン変異体アクチンを用意した。HEK293細胞の発現系にてテトラシステイン変異体を発現・精製し、２種のbifunctional dyeで蛍光修飾を試みた。当初作成したテトラシステイン変異体ではbifunctional dyeによるアクチン同士の架橋が起きたため再度変異部位を検討し、新たに作成したテトラシステイン変異体では蛍光色素による架橋を大幅に減らすことができた。蛍光修飾アクチンにて１分子FRETイメージングを行いFRETが起きていること、また天然型アクチンとの混合ではあるが重合能も確認している。しかし、この精製段階の蛍光修飾アクチンにはドナーしかもたないアクチンも含まれている。ドナーしかもたないアクチンはFRETイメージングのバックグラウンドになるため、さらに精製を行うことで検出感度の向上を目指す。
|
