公募研究
in vitro PIC形成アッセイでは、エンハンサー(GAL4DBD)、プロモーター(MLP)をもつテンプレートDNA上にアクチベーター(GAL-VP16)に依存し、mediator、GTF、RNApolIIを含むPICを安定に形成できる。さらに、このアッセイ中に、ATPもしくはNTPを添加すると、p-TEFb、AFF4などのelongation factorを含むEECがテンプレートDNA上にさらに形成された。この条件下で、コヒーシンローダー及びコヒーシンは、安定にテンプレートDNA上に会合することが分かった。それに加え、CDK9阻害剤であるDRBやFlavopridolを添加すると、pausing factorが安定に結合するのが観察され、同時にコヒーシンやコヒーシンローダーのより結合量の増加も見られた。ここで、核抽出液からNipblを除去すると、EECの形成が阻害された。続いて、CDK9阻害DRBを処理したHeLa S3細胞を用いて、コヒーシンローダー(Nipbl、Mau2)、コヒーシン(SA1、SA2)のChIP-seq解析を行った。DRB処理することで、プロモーターやエンハンサー領域でのコヒーシンローダー及びコヒーシンの結合量及び結合領域数が増加した。次に、DRBを除去し転写反応を再開させると、それらの結合量や領域数は減少した。以上、in vitroアッセイと細胞を用いた解析から、コヒーシンローダーもしくはコヒーシンは、転写の停止から伸長の移行にかけて機能することが明らかとなった
2: おおむね順調に進展している
n vitroのアッセイ系で、開始、停止、伸長への移行に応じた転写複合体の因子の検出に成功した。この過程で、コヒーシンやコヒーシンローダーが転写装置と結合する条件を決定することが出来た。同時に、ChIP-seq解析でも、コヒーシンローダーやコヒーシンの局在をより強く観察できる条件を決定できた。このように、in vitro及び細胞レベルでコヒーシンローダーやコヒーシンが転写に応じて機能する時期を特定できたことから、より絞って機能や機序への解析を進めていくことが出来る
今後は、in vitroのアッセイで、これまでの見てきた以外の関連因子の阻害や除去を行い、その中でのコヒーシンやコヒーシンローダーの局在を観察すると転写産物検出する。さらに、直接結合する因子についても探索を進めて、コヒーシンローダーの直接の制御因子を同定する。細胞レベルの解析では、上記で見られた因子のノックダウンを行い、コヒーシンローダー及びコヒーシンの動態の変化、反対にコヒーシンローダーをノックダウンした場合のRNAPol2、転写伸長や停止因子の動態を観察して、生体内でのコヒーシンローダーもしくはコヒーシンの役割を明らかにしていく。これらの結果を統合し、転写制御におけるコヒーシンローダーの役割について分子機構のモデル化を目指す。
すべて 2015
すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (1件) 図書 (1件)
Nat Commun.
巻: 6 ページ: 10924
10.1038/ncomms8815.
J Biol Chem
巻: 290 ページ: 21713-21723
10.1074/jbc.M114.628255.
Curr Biol.
巻: 25 ページ: 1694-1706
10.1016/j.cub.2015.05.017.
Nat Genet.
巻: 47 ページ: 338-344
10.1038/ng.3229.
