計画的細胞死に共役した細胞内小胞輸送の改変と細胞外シグナルの生成

2015 年度 実績報告書

• 研究領域: 細胞死を起点とする生体制御ネットワークの解明
• 研究課題/領域番号: 15H01382
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 鎌田 英明 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 准教授 (10233925)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: TNF / アポトーシス / ネクロプトーシス / 細胞内小胞輸送 / Rab11b / RIPK3

研究実績の概要

腫瘍壊死因子(TNFα)はIκBキナーゼ(IKKβ)を介してNF-κBを活性化するが、NF-κBが活性化されない細胞ではカスパーゼが活性化されてアポトーシスが誘導される。またカスパーゼの活性化が誘導されないときにはRIPK1、RIPK3、MLKLを介したネクロプトーシスが誘導されてDAMPsやサイトカインの放出にいたる。我々はTNFαによる細胞死と細胞内小胞輸送系を制御するRab11Bが密接に連関する事を見いだした。まずNF-κBの主要構成サブユニットRelAを欠損する細胞をTNFαで処理してカスパーゼを活性化すると、Rab11BのC末領域が切断されて膜から解離して分解されることを見いだした。さらにカスパーゼを抑制した条件化でネクロプトーシスを誘導すると、RIPK1やRIPK3から構成される複合体にRab11Bが会合することが確認された。またアポトーシスの誘導によりRIPK3はカスパーゼで分解される。これに対してネクロプトーシスによりRIPK3は細胞外に放出されるが、この過程をGFPで標識したRIPK3タンパク質を用いて蛍光顕微鏡下で実時間解析したところ、細胞膜の崩壊前と崩壊後に二つの過程でRIPK3は細胞外に放出さることや、細胞膜崩前の過程にRab11Bが関与することが判明した。さらにRab11Bのカスパーゼによる切断部位に変異を導入したノックインマウスと、Rab11B遺伝子にLoxＰ配列を導入したマウスを作成した。このマウスから細胞を取得して細胞死の応答を解析すると主に、Rab11Bと炎症と発がんとの連関を解析する予定である。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究では細胞内小胞輸送と細胞死との連関を解析することを目的としてRab11Bとアポトーシスおよびネクロプトーシスの関連を解析してきた。これまでの研究によりRab11Bのカスパーゼによる切断部位を同定するとともに、この切断に関与するカスパーゼを生化学的に同定することができた。さらにネクロプロ-シスにともなうRIPK3タンパク質とRab11Bの特異的な会合を確認した。さらにRIPK3の細胞内局在変化についての実時間解析により、RIPK3の細胞外放出へのRab11Bの関与を観察することにも成功した。そこで当初の計画に従い、カスパーゼの切断を受容しないRab11Bのノックインマウスの作成に取りかかり、現時点でカスパーゼ耐性のRab11B変異アレルをホモで有するマウスの作成に成功した。さらにRab11Bと細胞死との関連を明らかにするために、Rab11Bのコンディショナナルノックアウトマウスの作成にとりかかり、このマウスについても作成できたことが確認できた。Rab11Bのノックインマウスだけでなく、Rab11Bのコンディショナナルノックアウトマウスの作成も順調に進行し、さらに蛍光顕微鏡による実時間解析のデータも得られたことから、当初の計画以上に研究は進行していると考えている。

今後の研究の推進方策

当初の研究計画に従い、これまでに作成したRab11Bのカスパーゼによる切断部位に変異を導入したノックインマウスの炎症と発がんの応答を解析すると共に、取得した細胞を用いてRab11bと細胞死の連関の分子機構を解析する。Rab11B遺伝子にLoxＰ配列を導入したマウスを作成したマウスについて、これを　Cre発現マウスと交配して肝細胞特異的なノックアウトマウスを作成して、肝細胞死の応答を解析するとともに、炎症と発がんとの連関を解析し、この分子機構を解明してゆく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Involvement of resistin-like molecule β in the development of methionine-choline deficient diet-induced non-alcoholic steatohepatitis in mice. (2016)
  • 著者名/発表者名: Okubo H, Kushiyama A, Sakoda H, Nakatsu Y, Iizuka M, Taki N, Fujishiro M, Fukushima T, Kamata H, Nagamachi A, Inaba T, Nishimura F, Katagiri H, Asahara T, Yoshida Y, Chonan O, Encinas J, Asano T.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 6 ページ: 20157
  • DOI: 10.1038/srep20157
• [雑誌論文] HECT‐Type Ubiquitin E3 Ligase ITCH Interacts With Thioredoxin‐Interacting Protein and Ameliorates Reactive Oxygen Species Induced Cardiotoxicity (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoichiro Otaki, Hiroki Takahashi, Tetsu Watanabe, Akira Funayama, Shunsuke Netsu, Yuki Honda, Taro Narumi, Shinpei Kadowaki, Hiromasa Hasegawa, Shintaro Honda, Takanori Arimoto, Tetsuro Shishido, Takuya Miyamoto, Hideaki Kamata, Osamu Nakajima, Isao Kubota
  • 雑誌名: Am Heart Assoc. 巻: 5 ページ: e002485
  • DOI: 10.1161/JAHA.115.002485.
• [雑誌論文] Prolyl Isomerase Pin1 Negatively Regulates AMPK by Associating with the CBS Domain in the γ-subunit. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Nakatsu, Misaki Iwashita, Hideyuki Sakoda, Hiraku Ono, Kengo Nagata, Yasuka Matsunaga, Toshiaki Fukushima, Midori Fujishiro, Akifumi Kushiyama, Hideaki Kamata, Shin-Ichiro Takahashi, Hideki Katagiri,Hiroaki Honda, Hiroshi Kiyonari, Takafumi Uchida, and Tomoichiro Asano.
  • 雑誌名: Ｊournal of Biological Chemistry 巻: 290 ページ: 24255-24266
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.658559
• [雑誌論文] LUBAC formation is impaired in the livers of mice with MCD-dependent non-alcoholic steatohepatitis (2015)
  • 著者名/発表者名: Yasuka Matsunaga, Yusuke Nakatsu, Toshiaki Fukushima, Hirofumi Okubo, Misaki Iwashita, Hideyuki Sakoda, Midori Fujishiro, Takeshi Yamamotoya, Akifumi Kushiyama, Shin-Ichiro Takahashi, Yoshihiro Tsuchiya, Hideaki Kamata, Fuminori Tokunaga, Kazuhiro Iwai, and Tomoichiro Asano.
  • 雑誌名: Mediators of inflammation 巻: 2015 ページ: 125380
  • DOI: 10.1155/2015/125380.
• [雑誌論文] Pin1 inhibitor Juglone exerts anti-oncogenic effects on LNCaP and DU145 cells despite the patterns of gene regulation by Pin1 differing between these cell lines (2015)
  • 著者名/発表者名: Ryuhei Kanaoka, Akifumi Kushiyama, Yasuyuki Seno, Yusuke Nakatsu, Yasuka Matsunaga, Toshiaki Fukushima, Yoshihiro Tsuchiya, Hideyuki Sakoda, Midori Fujishiro, Takeshi Yamamotoya, Hideaki Kamata, Akio Matsubara, and Tomoichiro Asano.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 10 ページ: e0127467
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0127467.
• [雑誌論文] DPP-4 inhibitor anagliptin exerts anti-inflammatory effects on macrophages, adipocytes, and mouse livers by suppressing NF-κB activation (2015)
  • 著者名/発表者名: Takanori Shinjo, Yusuke Nakatsu, Misaki Iwashita, Tomoni Sano, Hideyuki Sakoda, Hisamitsu Ishihara, Akifumi Kushiyama, Midori Fujishiro, Toshiaki Fukushima, Yoshihiro Tsuchiya, Hideaki Kamata, Fusanori Nishimura1, Tomoichiro Asano.
  • 雑誌名: American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism 巻: 309 ページ: E214-23
  • DOI: 10.1152/ajpendo.00553.2014.
• [雑誌論文] The xanthine oxidase inhibitor febuxostat suppresses development of nonalcoholic steatohepatitis in a rodent model (2015)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Nakatsu, Yasuyuki Seno, Akifumi Kushiyama, Hideyuki Sakoda, Midori Fujishiro, Aya Katasako, Keiichi Mori, Yasuka Matsunaga, Toshiaki Fukushima, Ryuhei Kanaoka, Takeshi Yamamotoya, Hideaki Kamata, Tomoichiro Asano
  • 雑誌名: American Journal of Physiology - Gastrointestinal Liver Physiology 巻: 309 ページ: G42-51
  • DOI: 10.1152/ajpgi.00443.2014.
• [雑誌論文] Nedd4-induced mono-ubiquitination of IRS-2 enhances IGF signaling and mitogenic activity. (2015)
  • 著者名/発表者名: Toshiaki Fukushima, Hidehito Yoshihara, Haruka Furuta, Fumihiko Hakuno, Jing Luan, Cunming Duan, Yasushi Saeki, Keiji Tanaka, Shun-Ichiro Iemura, TohruNatsume, Kazuhiro Chida, Yusuke Nakatsu, Hideaki Kamata, Tomoichiro Asano, and Shin-Ichiro Takahashi
  • 雑誌名: Nature communications 巻: 6 ページ: 6780
  • DOI: 10.1038/ncomms7780
• [雑誌論文] Mosapride citrate improves nonalcoholic steatohepatitis with increased fecal lactic acid bacteria and plasma glucagon-like peptide-1 level in a rodent model. (2015)
  • 著者名/発表者名: Hirofumi Okubo, Yusuke Nakatsu, Hideyuki Sakoda, Akifumi Kushiyama, Midori Fujishiro, Toshiaki Fukushima, Yasuka Matsunaga, Haruya Ohno, Masayasu Yoneda, Hideaki Kamata, Takanori Shinjo, Misaki Iwashita, Fusanori Nishimura, and Tomoichiro Asano
  • 雑誌名: American Journal Physiolgy-Gastrointestinal and Liver Physiogy 巻: 308 ページ: 151-158
  • DOI: 10.1152/ajpgi.00198.2014.
• [学会発表] RelAの転写活性化ドメインを介したIKK活性制御機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 土谷佳弘 樋口徹 松永泰花 高橋江奈 中津祐介 浅野知一郎 鎌田英明
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会 第87回日本生化学会大会 合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 非アルコール性肝炎におけるLUBAC形成障害の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 松永泰花 中津祐介 福嶋俊明 大久保博史 岩下未咲 迫田秀之 藤城緑 山本屋武 櫛山暁史 高橋伸一郎 土谷佳弘 鎌田英明 徳永文稔 岩井一宏 浅野知一郎
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会 第87回日本生化学会大会 合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 計画的細胞死にともなう細胞内レドックスと小胞輸送系の改変 (2015)
  • 著者名/発表者名: 樋口徹 土谷佳弘 金本麻裕 高橋江奈 中津祐介 浅野知一郎 鎌田英明
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会 第87回日本生化学会大会 合同大会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04