NADPHオキシダーゼ活性の時空間的定量法の確立

2015 年度 実績報告書

• 研究領域: 酸素を基軸とする生命の新たな統合的理解
• 研究課題/領域番号: 15H01398
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 吉岡 博文 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30240245)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 活性酸素 / リン酸化酵素

研究実績の概要

ベンサミアナタバコ (Nicotiana benthamiana) においては、NbRBOHBが病害応答性CDPKやRLCKによってリン酸化され、ROS生産を誘導する。本年度は、２種の蛍光タンパク質 (YFP、CFP)、NbRBOHB由来のリン酸化配列を用いて、CDPKまたはRLCKによるリン酸化によって生ずる構造の変化に伴って蛍光共鳴エネルギー移動 (Foster Resonance Energy Transfer: FRET) が起こる２つのセンサーの基本構造を構築し、FRET効率の最適化を図った。
FRETシステムは、センサーのリン酸化時と非リン酸化時で異なる波長の蛍光として観察されるため、CDPKまたはRLCKの活性化を生細胞で蛍光として観察できる。２遺伝子発現型バイナリーベクターをベースとして、作製したセンサーとエフェクターをそれぞれ35Sプロモーターの下流に挿入した。エフェクターには、病害応答性CDPKの恒常活性型変異体 (NbCDPK5VK) および非活性型変異体 (NbCDPK5VK-KM) を用いた。これらバイナリーベクターを、アグロインフィルタレーション法によってベンサミアナタバコに導入して発現させ、葉組織から粗抽出液を調製し、マルチプレートリーダーを用いてFRET蛍光 (YFP/CFP) の強度を評価した。しかし、現在までに良好なFRET蛍光は得られていない。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

平成27年度は、センサーの基本構造を構築し、FRET効率を最適化する目的で様々なコンストラクトを作製した。FRET強度比 (ON時/OFF時) が1.3以上であることが、実用レベルのセンサーの目安とされている。一過的発現系を用いてベンサミアナ葉でFRET強度比(NbCDPK5VK / NbCDPK5VK-KM)を測定した結果、これまでに基準値以上のセンサーが得られていない。

今後の研究の推進方策

本年度は、センサーの構造を最適化する目的で、さらに多くのバリエーションを持たせたコンストラクトを作製し、FRET強度比が1.3以上であるセンサー構造を模索する。また、抗リン酸化抗体を用いた免疫ブロットによりセンサーのリン酸化を評価する。

研究成果

• [国際共同研究] LIPM(フランス)
  • 国名: フランス
  • 外国機関名: LIPM
• [雑誌論文] SGT1 contributes to maintaining protein levels of MEK2DD to facilitate hypersensitive response-like cell death in Nicotiana benthamiana. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ichimura, K., Shinzato, T., Edaki, M., Yoshioka, H. and Shirasu, K.
  • 雑誌名: Physiological and Molecular Plant Pathology 巻: 94 ページ: 47-52
  • DOI: org/10.1016/j.pmpp.2016.04.001
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Hierarchical regulation of NADPH oxidase by protein kinases in plant immunity. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka, H., Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Asai, S. and Yoshioka, M.
  • 雑誌名: Physiological and Molecular Plant Pathology 巻: 95 ページ: 20-26
  • DOI: org/10.1016/j.pmpp.2016.03.004
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Nicotiana benthamiana MAPK-WRKY pathway confers resistance to a necrotrophic pathogen Botrytis cinerea. (2016)
  • 著者名/発表者名: Adachi, H., Ishihama, N., Nakano, T., Yoshioka, M. and Yoshioka, H. (2016) Nicotiana benthamiana MAPK-WRKY pathway confers resistance to a necrotrophic pathogen Botrytis cinerea.
  • 雑誌名: Plant Signal. Behav. 巻: in press ページ: 未定
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A receptor pair with an integrated decoy converts pathogen disabling of transcription factors to immunity. (2015)
  • 著者名/発表者名: Le Roux, C., Huet, G., Jauneau, A., Camborde, L., Tremousaygue, D., Kraut, A., Zhou, B., Levaillant, M., Adachi, H., Yoshioka, H., Raffaele, S., Berthome, R., Coute, Y., Parker, J.E. and Deslandes, L.
  • 雑誌名: Cell 巻: 161 ページ: 1074-1088.
  • DOI: 10.1016/j.cell.2015.04.025.
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Cell death-inducing stresses are required for defense activation in DS1-phosphatidic acid phosphatase-silenced Nicotiana benthamiana. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakano, M., Yoshioka, H., Ohnishi, K., Hikichi, Y. and Kiba, A.
  • 雑誌名: J. Plant Physiol. 巻: 184 ページ: 15-19.
  • DOI: 10.1016/j.jplph.2015.06.007.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular characterization of LjABCG1, an ATP-binding cassette protein in Lotus japonicus. (2015)
  • 著者名/発表者名: Sugiyama, A., Fukuda, S., Takanashi, K., Yoshioka, M., Yoshioka, H., Narusaka, Y., Narusaka, M., Kojima, M., Sakakibara, H., Shitan, N., Sato, S., Tabata, S., Kawaguchi, M. and Yazaki, K.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 10 ページ: e0139127
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0139127.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] WRKY transcription factors phosphorylated by MAPK regulate a plant immune NADPH oxidase in Nicotiana benthamiana. (2015)
  • 著者名/発表者名: Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Yoshioka, M., Katou, Y., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
  • 雑誌名: Plant Cell 巻: 27 ページ: 2645-2663.
  • DOI: 10.1105/tpc.15.00213.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] リン酸化反応が制御するROSバーストの分子機構． (2015)
  • 著者名/発表者名: 吉岡博文・安達広明・石濱伸明・中野孝明・白石佑太郎・宮川典子・野村裕也・吉岡美樹・浅井秀太
  • 雑誌名: 日本植物病理学会報 巻: 81 ページ: 1-8.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Kinase-mediated orchestration of NADPH oxidase in plant immunity. (2015)
  • 著者名/発表者名: Adachi, H. and Yoshioka, H.
  • 雑誌名: Brief. Funct. Genomics 巻: 14 ページ: 253-259.
  • DOI: 10.1093/bfgp/elv004.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] 植物免疫に関わるNADPH oxidaseの活性化機構 (2015)
  • 著者名/発表者名: 吉岡博文
  • 学会等名: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会合同大会
  • 発表場所: 神戸ポートピアホテル
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • 招待講演
• [学会発表] Protein kinase-mediated regulation of NADPH oxidase in plant immunity. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka, H., Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Asai, S., Ishihama, N. and Yoshioka, M.
  • 学会等名: 11th US-Japan Scientific Seminar
  • 発表場所: 香川
  • 年月日: 2015-10-26 – 2015-10-29
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] MAPK-WRKY pathway up-regulates NbRBOHB gene and contributes to effector-triggered ROS burst in Nicotiana benthamiana. (2015)
  • 著者名/発表者名: Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Yoshioka, M., Katou, Y., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
  • 学会等名: The 4th International Conference on Biotic Plant Interactions.
  • 発表場所: 中国
  • 年月日: 2015-08-26 – 2015-08-29
  • 国際学会
• [学会発表] Transactivation of NbRBOHB gene via MAPK-WRKY pathway is essential for effector-triggered ROS burst in Nicotiana benthamiana. (2015)
  • 著者名/発表者名: Adachi, H., Ishihama, N., Nakano, T., Miyagawa, N., Yoshioka, M., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
  • 学会等名: 12th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants: from model systems to field.
  • 発表場所: イタリア
  • 年月日: 2015-05-24 – 2015-05-27
  • 国際学会
• [学会発表] RLCK-mediated phosphorylation of the N-terminus of RBOH regulates ROS burst in rice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka, M., Yamaguchi, K., Fujiwara, M., Yoshimura, S., Kawasaki, T. and Yoshioka, H.
  • 学会等名: 12th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants: from model systems to field.
  • 発表場所: イタリア
  • 年月日: 2015-05-24 – 2015-05-27
  • 国際学会
• [備考]
  • URL: http://www.agr.nagoya-u.ac.jp/~bio4283/index.html