NADPHオキシダーゼ活性の時空間的定量法の確立

2016 年度 実績報告書

• 研究領域: 酸素を基軸とする生命の新たな統合的理解
• 研究課題/領域番号: 15H01398
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 吉岡 博文 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30240245)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 活性酸素 / 植物免疫 / MAPキナーゼ

研究実績の概要

ベンサミアナタバコ (Nicotiana benthamiana) においては、NbRBOHBが病害応答性CDPKやRLCKによってリン酸化され、ROS生産を誘導する。本年度は、２種の蛍光タンパク質 (YFP、CFP)、NbRBOHB由来のリン酸化配列を用いて、CDPKまたはRLCKによるリン酸化によって生ずる構造の変化に伴って蛍光共鳴エネルギー移動 (Foster Resonance Energy Transfer: FRET) が起こる２つのセンサーの基本構造を構築し、FRET効率の最適化を図った。
FRETシステムは、センサーのリン酸化時と非リン酸化時で異なる波長の蛍光として観察されるため、CDPKまたはRLCKの活性化を生細胞で蛍光として観察できる。２遺伝子発現型バイナリーベクターをベースとして、作製したセンサーとエフェクターをそれぞれ35Sプロモーターの下流に挿入した。エフェクターには、病害応答性CDPKの恒常活性型変異体 (NbCDPK5VK) および非活性型変異体 (NbCDPK5VK-KM) を用いた。これらバイナリーベクターを、アグロインフィルタレーション法によってベンサミアナタバコに導入して発現させ、葉組織から粗抽出液を調製し、マルチプレートリーダーを用いてFRET蛍光 (YFP/CFP) の強度を評価した。しかし、現在までに良好なFRET蛍光は得られていない。そこで、NbRBOHB遺伝子の転写を制御するWRKY8転写因子を同定し、この転写因子を活性化するMAPKの活性化を可視化することを可能にしたMAPKバイオセンサーの開発に成功した。このセンサーをベンサミアナタバコに一過的に導入して発現させた結果、病原菌の感染シグナルに応答したFRET蛍光が観察された。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] An NADPH oxidase RBOH functions in rice roots during lysigenous aerenchyma formation under oxygen-deficient conditions. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamauchi, T., Yoshioka, M., Fukazawa, A., Mori, H., Nishizawa, N.K., Tsutsumi, N., Yoshioka, H. and Nakazono, M.
  • 雑誌名: The Plant Cell 巻: 印刷中 ページ: 未定
  • DOI: org/cgi/doi/10.1105/tpc.16.00976
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] 植物免疫における活性酸素生成誘導のしくみ―植物はいかにして病原菌から身を護るのか？ (2017)
  • 著者名/発表者名: 安達広明・吉岡博文
  • 雑誌名: 化学と生物 巻: 印刷中 ページ: 未定
• [雑誌論文] SGT1 contributes to maintaining protein levels of MEK2DD to facilitate hypersensitive response-like cell death in Nicotiana benthamiana. (2016)
  • 著者名/発表者名: Ichimura, K., Shinzato, T., Edaki, M., Yoshioka, H. and Shirasu, K.
  • 雑誌名: Physiological and Molecular Plant Pathology 巻: 94 ページ: 47-52
  • DOI: org/10.1016/j.pmpp.2016.04.001
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Hierarchical regulation of NADPH oxidase by protein kinases in plant immunity. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka, H., Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Asai, S. and Yoshioka, M.
  • 雑誌名: Physiological and Molecular Plant Pathology 巻: 95 ページ: 20-26
  • DOI: org/10.1016/j.pmpp.2016.03.004
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Nicotiana benthamiana MAPK-WRKY pathway confers resistance to a necrotrophic pathogen Botrytis cinerea. (2016)
  • 著者名/発表者名: Adachi, H., Ishihama, N., Nakano, T., Yoshioka, M. and Yoshioka, H.
  • 雑誌名: Plant Signaling & Behavior 巻: 11 ページ: e1183085
  • DOI: org/10.1080/15592324.2016.1183085
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] Live-imaging of MAPK activity in plant immune responses (2017)
  • 著者名/発表者名: 安達広明・石濱伸明・吉岡美樹・鳴坂真理・鳴坂義弘・吉岡博文
  • 学会等名: 第58回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 鹿児島大学、鹿児島
  • 年月日: 2017-03-16 – 2017-03-18
• [学会発表] 植物免疫に関与するMAPキナーゼによる活性酸素生成機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 吉岡博文
  • 学会等名: 第４回新学術領域研究「酸素生物学」公開シンポジウム
  • 発表場所: 九州大学
  • 年月日: 2017-02-09 – 2017-02-09
  • 招待講演
• [学会発表] 免疫応答におけるSIPKの細胞内動態 (2016)
  • 著者名/発表者名: 安達広明、波多江健太、吉岡美樹、鳴坂真理、鳴坂義弘、吉岡博文
  • 学会等名: 平成28年度日本植物病理学会関西部会
  • 発表場所: 静岡県コンベンションアーツセンター，静岡
  • 年月日: 2016-09-28 – 2016-09-29
• [学会発表] Phosphorylation of rice RBOH by CERK1-associated RLCK mediates chitin-triggered ROS burst. (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka, M., Yamaguchi, K., Fujiwara, M., Yoshimura, S., Kawasaki, T. and Yoshioka, H.
  • 学会等名: XVII International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions.
  • 発表場所: Portland
  • 年月日: 2016-07-17 – 2016-07-21
  • 国際学会
• [学会発表] 葉緑体による活性酸素生成を介した植物免疫機構.「活性酸素が支える生体防御力」 (2016)
  • 著者名/発表者名: 吉岡博文・安達広明
  • 学会等名: 第27回日本生体防御学会学術総会
  • 発表場所: 九州大学
  • 年月日: 2016-07-07 – 2016-07-09
  • 招待講演
• [学会発表] Protein kinases hierarchically regulate a plant immune NADPH oxidase (2016)
  • 著者名/発表者名: Yoshioka, H
  • 学会等名: The 9th International Conference on the Biology, Chemistry, and Therapeutic Applications of Nitric Oxide
  • 発表場所: 仙台国際センター、仙台
  • 年月日: 2016-05-20 – 2016-05-22
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考]
  • URL: http://www.agr.nagoya-u.ac.jp/%7ebio4283/index.html