| 研究実績の概要 |
EMC 欠損変異細胞において欠損する膜タンパク質の翻訳がC末端まで行われているかを検討するため、 T2A 配列を用いた解析を行った。リボソームが T2A 配列に達すると、 T2A 配列の最後のアミノ酸が組み込まれることなく新生鎖が一度切り離され、引き続いてその下流の配列が翻訳される。したがって、ロドプシン Rh1 のC末端に T2A-GFP をコードする配列を融合することによって、 GFP の発現の有無から Rh1 の翻訳が完了しているのか途中で停止しているのかを検討することが可能である。 EMC1655G 変異細胞において Rh1-V5-T2A-GFP を発現誘導した結果、 GFP は野生型細胞と同程度発現したのに対し、 Rh1-V5-T2A はごく少量しか検出されなかった。このことから、 EMC は膜タンパク質の翻訳には関与していないことが示され、 EMC 欠損細胞では合成された膜タンパク質が分解されていると考えられた。
EMC が挿入過程の膜タンパク質と相互作用することを証明するために、リボソーム・新生鎖複合体の状態にあるウシロドプシンとEMCを BMH を用いてシステイン間架橋することを試みた。 Stephen High らの研究グループは RNC の状態にあるウシロドプシンと BMH によって架橋されるタンパク質を検討し、約 10 kDa の未知のタンパク質 PAT10 を発見していた (Ismail, et al., 2008)。 PAT10が EMCのサブユニット EMC5 または EMC6 である可能性を考え再現実験を行った。その結果、 PAT10 を架橋することに成功したが、膜画分を加えない in vitro 翻訳系においても PAT10 が非常に高い効率で架橋されたたため、 PAT10 はリボソームのサブユニットである可能性が高い。
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