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2016 年度 実績報告書

ピコルナウイルスの2Aペプチドの終止コドン非依存的翻訳終結の構造基盤

公募研究

研究領域新生鎖の生物学
研究課題/領域番号 15H01548
研究機関国立研究開発法人理化学研究所

研究代表者

伊藤 拓宏  国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, ユニットリーダー (70401164)

研究期間 (年度) 2015-04-01 – 2017-03-31
キーワードウイルス / 生体分子 / 電子顕微鏡 / 翻訳
研究実績の概要

リボソームを一時停止させた後に、N末端側にPAタグ配列を付加しておくことにより、抗PA抗体樹脂を用いて、FLAG配列の場合と同様に、停止したリボソームを選び出して精製することが可能であることを見出した。リボソームを一時停止させるために精製したヒト由来因子によって再構成した試験管内翻訳システムを用いるが、その大量反応の系を構築した。リボソームの60Sおよび40Sサブユニット、翻訳開始因子eIF3、eIF2、翻訳伸長因子eEF2、tRNAミックスについては大量に培養したHeLa細胞から効率よく精製する系を構築した。また、eIF2BやeEF1、DHX29、アミノアシルtRNA合成酵素群などについては、FreeStyle 293-Fを用いた培養システムにより大量に効率よく精製する系を構築した。eIF1やeIF1Aなどの因子については大腸菌を用いて大量に精製した。この試験管内翻訳システムの大量反応とPAタグを用いて精製したリボソームを用いてcryoEMによる単粒子解析を行い、グローバルマップとして4Åを切る分解能で構造解析が可能であることを見出した。開始粒子数を増やせば4Åを切る最終構造を算出することが可能であることが示された。
ピコルナウイルスの2Aペプチド1位のグリシンまで合成した状態で、-1位のプロリンにペプチド転移反応を起こさずにリボソームを一時停止させる手法として、tRNA(Gly)の2'にOHではなくNHにグリシンが結合している分子の合成を開始した。

現在までの達成度 (段落)

28年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

28年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 2件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (3件) (うち国際学会 2件、 招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Solution structure of the first RNA recognition motif domain of human spliceosomal protein SF3b49 and its mode of interaction with a SF3b145 fragment2017

    • 著者名/発表者名
      Kuwasako, K.
    • 雑誌名

      Protein Science

      巻: 26 ページ: 280-290

    • DOI

      10.1002/pro.3080

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Trm5 and TrmD: two enzymes from distinct origins catalyze the identical tRNA modification, m1G372017

    • 著者名/発表者名
      Goto-Ito, S.
    • 雑誌名

      Biomolecules

      巻: 7 ページ: E32

    • DOI

      10.3390/biom7010032

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Crystal structure of eIF2B and insights into eIF2-eIF2B interactions2017

    • 著者名/発表者名
      Kashiwagi, K.
    • 雑誌名

      FEBS Journal

      巻: 284 ページ: 868-874

    • DOI

      10.1111/febs.13896

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] 翻訳開始因子eIF2Bの立体構造‐CATH/VWM型白質脳症の発症機構解明への手がかりとして2017

    • 著者名/発表者名
      柏木 一宏
    • 雑誌名

      BRAIN and NERVE-神経研究の進歩

      巻: 69 ページ: 45-50

    • DOI

      10.11477/mf.1416200635

  • [雑誌論文] Methyl transfer by substrate signaling from a knotted protein fold2016

    • 著者名/発表者名
      Christian, T.
    • 雑誌名

      Nature Structural and Molecular Biology

      巻: 23 ページ: 941-948

    • DOI

      10.1038/nsmb.3282

    • 査読あり / 国際共著
  • [学会発表] Crystal structure of eukaryotic translation initiation factor 2B (eIF2B)2016

    • 著者名/発表者名
      Kazuhiro Kashiwagi
    • 学会等名
      The RNA Society / The RNA Society of Japan
    • 発表場所
      京都国際会議場(京都)
    • 年月日
      2016-09-26
    • 国際学会
  • [学会発表] Crystal sturucture of eukaryotic translation initiation factor 2B2016

    • 著者名/発表者名
      Takuhiro Ito
    • 学会等名
      Nascent Chain Biology Meeting 2016
    • 発表場所
      富士レークホテル(山梨)
    • 年月日
      2016-09-01
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] 翻訳開始因子 eIF2B の結晶構造2016

    • 著者名/発表者名
      柏木 一宏
    • 学会等名
      日本蛋白質科学会
    • 発表場所
      福岡国際会議場(福岡)
    • 年月日
      2016-06-08

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公開日: 2018-01-16  

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