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われわれは、細胞膜を透過性にして細胞質交換を可能にした「セミインタクト細胞リシール技術」を開発し、細胞内への生体物質導入法や導入した物質の様々な細胞内生命現象への影響などを光学顕微鏡下で可視化解析するシステムを構築している。この細胞内操作システムは、多種類のタンパク質成分や膜不透過性の(天然)化合物を、同時に定量的に細胞内に導入することが可能であり、かつオルガネラや細胞骨格の構造とトポロジーが保持されているため、導入されたタンパク質(群)の様々な動的平衡状態を「真の細胞環境内に近い状態で」計測できる。昨年度までに、in cell NMR測定に必要と思われる浮遊状態の細胞(基質からトリプシン処理により遊離させたHeLa細胞、T細胞系の株化細胞や個体から調製した血球系細胞など)をターゲットにしたリシール細胞法の基本プロトコルを作成した。今年度は、その基本プロトコルをさらに進化させ、(１)リシール操作後の細胞のviabilityや生存率の向上を目指す条件検討を行った。その結果、リシール効率及び生存率を飛躍的に増加させる化合物を数種類発見した。当該化合物の作用機序を解明することで，リシール操作に必要な細胞質成分の探索系を構築した。この他、(２)解析対象となるタンパク質や生体分子を導入したリシール細胞に、後から膜不透過性の中分子を、簡単にしかもリシール細胞にダメージを与えない状態で導入する新規の中分子導入法法を開発した。(３)これら膜不透過性中分子の細胞内での機能解析を生化学的手法または光学顕微鏡下の単一細胞レベルで定量的に解析する基本解析プロトコルを構築した。
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