| 研究領域 | 動的構造生命科学を拓く新発想測定技術－タンパク質が動作する姿を活写する－ |
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| 研究課題/領域番号 |
15H01637
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
浜地 格 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90202259)
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | タンパク質 / 生細胞 / ケミカルラベル / イメージング / 動的構造 |
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| 研究実績の概要 |
近年のタンパク質研究においては、単離精製したタンパク質の精密構造解析から、本来機能する生細胞における解析および評価へと研究の重要性がシフトしている。それに伴い、新規な方法論の開発が世界中で活発に進められているが、いずれの手法においてもタンパク質を遺伝子工学的に改変し、一過的に発現させる必要がある。我々は遺伝子操作することなく細胞に内在的に発現するタンパク質を化学修飾できる独自の方法「リガンド指向型化学」を報告した。本研究では、これまでに達成できていない、細胞内タンパク質に対する新たなラベル化法、および小分子リガンドを有さない膜タンパク質に対するラベル化法の開発を研究目的としている。
平成27年度は、小分子リガンドを有さないタンパク質に対するラベル化法として、抗体にアシル基転移反応の触媒として機能するジメチルアミノピリジン(DMAP)をコンジュゲートした反応性抗体を作製し、抗体の特異性とDMAPの触媒活性を協同的に作用させることによって、細胞表層のタンパク質をラベル化する方法(ScFv-DMAP法)の開発に成功した。この方法を用いて、膜受容体タンパク質の動的な揺らぎをケミカルラベルによってマッピングでき、細胞膜上での動的な構造変化の解析が可能であることを実証した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度は、細胞内でのラベル化が可能な新しいリガンド指向性の開発および、小分子リガンドを有さないタンパク質標的に対するラベル化法の展開研究を実施した。
細胞内でのタンパク質ラベル化においては、プロテアーゼなどの分解酵素に作用されず、また高濃度に存在する細胞内小分子には作用しない反応基の適用が求められる。我々は、新たな反応基としてN-スルフォニルピリドン基が細胞内でのタンパク質ラベル化に適用可能かどうかを評価した。その結果、幾つかの細胞内在性のタンパク質に対して、これまでのリガンド指向性化学よりも優れた効率でラベル化が進行することを見出した。
また、小分子リガンドを有さないタンパク質に対するラベル化に関しては、抗体に着目し、それにアシル基転移反応の触媒として機能するジメチルアミノピリジン(DMAP)をコンジュゲートした、新しい反応性抗体の開発に成功した。これを用いると、抗体の特異性とDMAPの触媒活性を協同的に作用させることによって、細胞表層のタンパク質をラベル化する(ScFv-DMAP法)ことが可能であった。例えば、乳ガン細胞マーカーとして知られる増殖因子受容体の一種であるHER2タンパク質を標的とし、HER2に対するScFvを用いてラベル化することが可能であった。またEGFRを標的に相互作用点が不明な抗体(affibody)をコンジュゲート担体に用いると、ラベル化部位の詳細な解析から膜受容体と抗体との相互作用点（エピトープ）を推定／確定できることが実証することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、細胞内でのラベル化が可能な新しいリガンド指向性化学の反応機構について、さらなる解析を行い、その開発指針を提示する。また、神経伝達物質受容体を例に、細胞膜において動的に揺らいでいるコンフォメーションを活性型に固定化して、生細胞での機能を制御する化学的方法論（Chemical Geneticsの一つ）の構築を検討する。
細胞内でのラベル化に関しては、前年度までの検討において、明らかにしてきた細胞内で加水分解等の副反応を受けにくく、特定のタンパク質を選択的にラベル化できる反応基（N-スルフォニルピリドン基）について、その反応基に置換基を導入して反応性をチューニングすることにより、細胞内タンパク質のラベル化に最適な反応性を定量的に予測／評価できるかどうかを検討する。また、反応性の予測では計算化学を活用し、実際に実験で得られるデータとの相関性を評価していく。
さらに、膜結合性の神経伝達物質受容体の動的な活性制御法に関しては、近年急激に進みつつある構造解析のデータを基にしながら、その動的なコンフォメーション変化の制御する試みを行う。具体的には、アミノ酸の点変異と人工金属錯体（認識分子）との組み合わせによって、受容体タンパク質を活性型コンフォメーションに動的に固定化するための新しい戦略の開発を行う。リガンド結合ドメインの構造変化がチャネル部分の構造変化に伝わるということが、構造解析から推定されているグルタミン酸受容体をテンプレートとして、His変異と細胞表層での配位化学：OcCCによるグルタミン酸受容体の動的構造制御およびチャネル活性のChemical genetics的なコントロールに挑む。
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