構造情報に基づいた機能変換による膜孔形成毒素の会合機構の解明

2017 年度 実績報告書

• 研究領域: 生命分子システムにおける動的秩序形成と高次機能発現
• 研究課題/領域番号: 16H00748
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: 膜孔形成毒素 / タンパク質工学

研究実績の概要

病原性微生物がホスト細胞に障害を与えるために産生する膜孔形成毒素は，可溶性の単量体として分泌されるが，ターゲット細胞に接すると膜上でpreporeと呼ばれる円状の会合体を形成した後，劇的な構造変化を起こして膜孔を形成する．黄色ブドウ球菌は，3種類の非常に類似した膜孔形成毒素（Hla，LukF，Hlg2）を分泌するが，Hlaはホモ7量体の膜孔を形成するのに対し，LukF，Hlg2は交互に会合したヘテロ8量体の膜孔を形成する．毒素同士がどのようにして特定のパートナーとのみ特異的に会合して膜孔を形成するのか，また，7量体・8量体という分子の会合数がどのようにして決定されるのかについては，明らかにできていない．
本研究では，構造解析から提唱された機構を基に変異体蛋白質を合理設計し，毒素の会合特性を改変することを通して，これらの毒素の自己組織化機構を解明することを目指した．立体構造情報をもとに，Hlg2とLukFの接触界面を移植したキメラ変異体を2種類作成した．また，コンピュータシミュレーションにより単量体として機能できるように，界面の残基の変異体を設計した．4種類の変異体を作成した．これらに加え，2成分性毒素の各成分に対し，ステム領域をHlaのもので置換した変異体と，さらにその周辺の重要残基に変異を加えたキメラ変異体を合計16種類作成した．これらのキメラ変異体の溶血活性を種々の条件下で評価した結果，LukFのステム領域はHlaのステム領域で置換可能であることがわかった．また，Hlaのステムで置換したHlg2の種々の変異体のCDスペクトルから，ステム領域の入れ替えにより，単量体の構造に変化が起きていることが示された．また，一連の実験の過程で， Hlg2，LukFのリフォールディングの手法が確立された．

現在までの達成度 (段落)

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] スタンフォード大学(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: スタンフォード大学
• [国際共同研究] マックスプランク研究所(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: マックスプランク研究所
• [雑誌論文] Protein encapsulation in the hollow space of hemocyanin crystals containing a covalently conjugated ligand (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsubasa Hashimoto, Yuxin Ye, Mihoko Ui, Tohohisa Ogawa, Takashi Matsui, and Yoshikazu Tanaka
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.04.062
  • 査読あり
• [雑誌論文] CryoEM reveals the asymmetric assembly of squid hemocyanin (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshikazu Tanaka, Sanae Kato, Makus Stabrin, Stefan Raunser, Takashi Matsui, and Christos Gatsogiannis
  • 雑誌名: IUCRj 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: https://doi.org/10.1107/S205225251900321X
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] SDS-induced oligomerization of Lys49-phospholipase A2 from snake venom (2019)
  • 著者名/発表者名: Takashi Matsui, Shizuka Kamata, Kentaro Ishii, Takahiro Maruno, Nouran Ghanem, Susumu Uchiyama, Koichi Kato, Atsuo Suzuki, Naoko Oda-Ueda, Tomohisa Ogawa and Yoshikazu Tanaka
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 9 ページ: 2330
  • DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-019-38861-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Encapsulation of biomacromolecules by soaking and co-crystallization into porous protein crystals of hemocyanin (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsubasa Hashimoto, Yuxin Ye, Asuka Matsuno, Yuki Ohnish, Akira Kitamura, Masataka Kinjo, Satoshi Abe, Takafumi Ueno, Min Yao, Tomohisa Ogawa, Takashi Matsui, Yoshikazu Tanaka
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Commun. 巻: 509 ページ: 577-584
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.12.096
  • 査読あり
• [雑誌論文] staphylococcal bi-component toxin for β-barrel pore assembly (2018)
  • 著者名/発表者名: Kein Takeda, Yoshikazu Tanaka, Naoki Abe, Jun Kaneko
  • 雑誌名: Toxicon 巻: 155 ページ: 43-48
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2018.10.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] Compact Seahorse-Shaped T Cell-Activating Antibody for Cancer Therapy (2018)
  • 著者名/発表者名: Hiroto Fujii, Yoshikazu Tanaka, Hikaru Nakazawa, Aruto Sugiyama, Noriyoshi Manabe, Akira Shinoda, Nobutaka Shimizu, Takamitsu Hattori, Katsuhiro Hosokawa, Takuma Sujino, Tomoyuki Ito, Teppei Niide, Ryutaro Asano, Izumi Kumagai, and Mitsuo Umetsu
  • 雑誌名: Adv. Therapeut. 巻: 1 ページ: 1700031
  • DOI: DOI: 10.1002/adtp.201700031
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rim domain loops of Staphylococcal β-pore forming bi-component toxin S-components 3 recognize target human erythrocytes in a coordinated manner (2018)
  • 著者名/発表者名: Zhao Peng, Miyu Takeshita, Nao Shibata, Hideaki Tada, Yoshikazu Tanaka, Jun Kaneko
  • 雑誌名: J. Biochem. 巻: 164 ページ: 93-102
  • DOI: doi: 10.1093/jb/mvy030.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heme Binding to Porphobilinogen Deaminase from Vibrio cholerae Decelerates the Formation of 1-Hydroxymethylbilane (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Uchida, Takumi Funamizu, Minghao Chen, Yoshikazu Tanaka, Koichiro Ishimori
  • 雑誌名: ACS Chem. Biol. 巻: 13 ページ: 750-760
  • DOI: doi: 10.1021/acschembio.7b00934
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molluscan Hemocyanin: Structure, Evolution, and Physiology (2018)
  • 著者名/発表者名: Sanae Kato, Takashi Matsui, Christos Gatsogiannis, Yoshikazu Tanaka
  • 雑誌名: Biophysical Reviews 巻: 10 ページ: 191-202
  • DOI: doi: 10.1007/s12551-017-0349-4.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Structural basis for tRNA-dependent cysteine biosynthesis (2017)
  • 著者名/発表者名: Meirong Chen, Koji Kato, Yume Kubo, Yoshikazu Tanaka, Yuchen Liu, Feng Long, William B. Whitman, Pascal Lill, Christos Gatsogiannis, Stefan Raunser, Nobutaka Shimizu, Akira Shinoda, Akiyoshi Nakamura, Isao Tanaka, Min Yao
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 8 ページ: 1512
  • DOI: doi: 10.1038/s41467-017-01543-y
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] pH Regulates Pore Formation of a Protease Activated Vip3Aa from Bacillus thuringiensis (2017)
  • 著者名/発表者名: Thittaya Kunthic, Hirokazu Watanabe, Ryuji Kawano,Yoshikazu Tanaka, Boonhiang Promdonkoy, Min Yao, Panadda Boonserm
  • 雑誌名: BBA Biomembranes 巻: 1859 ページ: 2234-2241
  • DOI: doi: 10.1016/j.bbamem.2017.08.018.
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] 蛋白質結晶中の巨大な空隙へのタンパク質の包摂 (2019)
  • 著者名/発表者名: 橋本翼, 松井崇, 小川智久，田中良和
  • 学会等名: PFシンポジウム
• [学会発表] スルメイカ由来ヘモシアニンのクライオ電顕構造とX 線結晶構造の違い (2018)
  • 著者名/発表者名: 田中良和，松井崇，加藤早苗，Christos Gatsogiannis, Stefan Raunser
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会
• [学会発表] Molecular Mechanism of Staphylococcal Pore Forming Toxin (2018)
  • 著者名/発表者名: Yoshikazu TANAKA, Jun KANEKO
  • 学会等名: The 79th Okazaki Conference Synthetic, Biological, and Hybrid Molecular Engines
  • 国際学会
• [学会発表] 巨大蛋白質会合体ヘモシアニンの構造解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 田中良和
  • 学会等名: 日本生物物理学会 東北支部会
• [学会発表] X線結晶構造解析とクライオ電顕、両手法を使って (2018)
  • 著者名/発表者名: 田中良和
  • 学会等名: フォトンファクトリー研究会 X線とクライオ電子顕微鏡で挑む生命の機能とかたち
  • 招待講演