| 研究実績の概要 |
我々は、細胞サイズのリポソーム内で再構成型無細胞翻訳系PURE systemを用いて膜タンパク質を合成する技術を確立してきた。リポソームディスプレイ法と名付けたこの技術は、膜タンパク質の進化分子工学だけでなく、細胞環境に近い反応場での膜タンパク質の機能解析を可能とする。
生体膜上での高次の生命現象の多くは、発現のダイナミクスが制御された複数種の膜タンパク質が協同的に働くことで進行する。現行のリポソームディスプレイ法は、複数種の膜タンパク質を発現させることは可能だが、各タンパク質の発現のタイミングを制御できない。そこで本研究では、光によって異性化するアゾベンゼン2,6-dimethylazobenzene-4’-carboxylic acid (DM-Azo)と2,6-dimethyl-4-(methylthio)azobenzene-4′-carobxylic acid (S-DM-Azo)を導入したオリゴDNAを用いる事でリポソーム内膜タンパク質合成反応のダイナミクスを制御する技術の確立とその応用を目指した。
まず、緑色蛍光タンパク質（GFP）をモデルタンパク質として用い、その発現の光制御技術の確立を行った。オリゴDNA配列をGFP遺伝子の開始コドン付近に会合し、リボソームによる翻訳反応を阻害するようデザインした。その結果、DM-Azoを用いたオリゴDNAのほうがS-DM-Azoよりも合成反応を効率的に停止させる事、オリゴへの適切なDM-Azo挿入位置を明らかにした。次に、上記の情報を用いて膜タンパク質の膜透過装置Secトランスロコンとモデル膜タンパク質である大腸菌由来多剤排出トランスポーターEmrEの発現の制御を試みた。SecトランスロコンとEmrEを両方同時に合成し、光照射によりSecトランスロコンの翻訳のみを停止させる事に成功した。リポソーム内で、この反応を実施する事により、Secトランスロコンの存在下に於いてEmrEを合成すること、すなわち細胞模擬環境が実現可能となる。
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