リポクオリティとラフト構造・機能の相関の高精度１分子観察による解明

2016 年度 実績報告書

• 研究領域: 脂質クオリティが解き明かす生命現象
• 研究課題/領域番号: 16H01358
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 鈴木 健一 京都大学, 物質－細胞統合システム拠点, 特定拠点准教授 (50423059)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2018-03-31
• キーワード: ラフト / 細胞膜ドメイン / １分子観察 / スフィンゴミエリン / GPIアンカー型タンパク質 / 糖脂質

研究実績の概要

脂質ラフトは、細胞膜上のシグナル伝達のプラットフォームとして注目されてきたが、その構造やシグナル伝達における役割などの実体は、いまだ解明されておらず、大論争の最中にある。細胞膜を構成する脂質の種類が非常に多いために、ラフトドメインと非ラフトの領域の境界の線張力が下がり、大きなラフトができないことが、ラフト研究の難しさの原因とされている。本研究の目的は、細胞膜上の小さなラフトの形成機構と、ラフトがその小ささを生かしながらどのように機能（細胞内へのシグナル伝達や抑制）するのかを、高精度1分子イメージング法を用いて解明し、脂質クオリティの多様性の生理的意義の一つを見出すことである。
当年度、ラフト脂質マーカーであるスフィンゴミエリン(SM)プローブ、DSPCプローブ、非ラフト脂質マーカーであるDOPCプローブを開発（世界初）し、そのキャラクタリゼーションを終えることができた。これらのラフト、非ラフトリン脂質を開発したことにより、以後、ラフト研究が格段に進むと期待できる。
我々は、これらのプローブの1分子イメージングを行い、小さなラフト形成機構の解明を試みた。スフィンゴミエリンプローブは、GPIアンカー型タンパク質CD59の刺激前後ともに、CD59を含むラフトにダイナミックに出入りし、CD59の会合度が増加するにつれ、より長期間リクルートされることを見出した。一方で、非ラフトリン脂質DOPCの場合には、刺激の有無に関わらず、短い時間しか共局在しなかった。さらに、ラフトに対する親和性が曖昧であったFcepsilon受容体についても、リガンド添加して受容体会合後にだけ、スフィンゴミエリンプローブの長期間のリクルートが観察された。これらの結果から、定常状態の細胞上でも、短寿命のラフトが形成されているが、受容体刺激後、より安定な（しかしなおもダイナミックな）ラフトが形成されることが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今まで、ラフトに分配されるスフィンゴミエリンプローブが存在しなかったが、これを開発できた意義は大きい。さらにスフィンゴミエリンプローブは、ライセニンなどのタンパク質との結合活性を保持（天然のスフィンゴミエリンの６割程度）していることも明らかになった。さらに、ホスファチジルコリンの構造を保持したDSPCプローブやDOPCプローブを開発できた。これらの蛍光リン脂質プローブを用いたライブイメージング（１分子イメージング）によって、ラフト研究が格段に進むと期待できる。
また、開発したリン脂質プローブを用いて、ラフト形成過程を可視化できたことも重要である。ここで得た結果は、CD59やFcepsilon受容体などは、まずタンパク質相互作用によりダイマーやオリゴマーなどの会合体が誘起され、それから協同的なラフト脂質相互作用により会合体が安定化されること、をさらに裏付けた。当初の目標を達成しており、研究計画は順調といえる。

今後の研究の推進方策

当年度に新脂質プローブを0.5ミリ秒の時間分解能で1分子観察したことにより、ラフト分子の拡散を止めるような小さな膜領域は存在せず、観察したどの分子も、細胞膜上を拡散し続けることを明らかにした。
今後は、さらに時間分解能を0.1ミリ秒まで上げて、1分子観察する。ラフト分子が、細胞膜のコンパートメント間を飛び移る頻度を調べ、非ラフト分子と比較する。もしラフトが大きければ、飛び移る頻度が下がるはずである。モンテカルロシミュレーションにより、ラフトサイズを求める。
細胞膜脂質同士の表裏カップリングによるラフト形成があるかどうかを検証する。そのため、ホスファチジルセリン(PS)を欠損したCHO細胞膜とインタクト細胞膜上で、リン脂質プローブの拡散を比較する。また、様々なアルキル鎖長のリン脂質プローブを合成し、拡散を比較し、プローブの会合を比較し、表裏カップリングの有無を検証する。
刺激後のラフトが小さいとシグナル伝達効率が上がるという仮説を検証する。そのため、様々なサイズのCD59会合体を形成させて、3色同時1分子観察によりCD59直下でのシグナル分子の活性化を観察し、シグナル伝達効率を求める。これにより、CD59会合体の大きさとシグナル伝達効率の関係を調べる。

研究成果

• [国際共同研究] 国立生命科学研究センター(NCBS)/幹細胞・再生医学研究所(inStem)(インド)
  • 国名: インド
  • 外国機関名: 国立生命科学研究センター(NCBS)/幹細胞・再生医学研究所(inStem)
• [雑誌論文] Raft-based sphingomyelin interactions revealed by new fluorescent sphingomyelin analogs (2017)
  • 著者名/発表者名: Masanao Kinoshita*, Kenichi G. N. Suzuki* (*equal contribution), Nobuyuki Matsumori, Misa Takada, Hikaru Ano, Kenichi Morigaki, Mitsuhiro Abe, Asami Makino, Toshihide Kobayashi, Koichiro M. Hirosawa, Takahiro K. Fujiwara, Akihiro Kusumi, and Michio Murata.
  • 雑誌名: J. Cell Biol. 巻: 216 ページ: 1183-1204
  • DOI: 10.1083/jcb.201607086
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] ガングリオシドプローブの1分子観察によりラフト動態を探る (2017)
  • 著者名/発表者名: 鈴木健一
  • 雑誌名: 生化学 巻: 89 ページ: 121-125
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2017.890121
  • 査読あり
• [雑誌論文] Raft-based interactions of gangliosides with a GPI-anchored receptor (2016)
  • 著者名/発表者名: Naoko Komura*, Kenichi G. N. Suzuki*, Hiromune Ando* (*equal contribution), Miku Konishi, Machi Koikeda, Akihiro Imamura, Rahul Chadda, Takahiro K. Fujiwara, Hisae Tsuboi, Ren Sheng, Wonhwa Cho, Koichi Furukawa, Keiko Furukawa, Yoshio Yamauchi, Hideharu Ishida, Akihiro Kusumi and Makoto Kiso.
  • 雑誌名: Nat. Chem. Biol. 巻: 12 ページ: 402-410
  • DOI: 10.1038/nchembio.2059
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Confined diffusion of transmembrane proteins and lipids induced by the same actin meshwork lining the plasma membrane. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takahiro K. Fujiwara, Kokoro Iwasawa, Ziya Kalay, Taka A. Tsunoyama, Yusuke Watanabe, Yashuhiro M. Umemura, Hideji Murakoshi, Kenichi G. N. Suzuki, Yuri N. Nemoto, Nobuhiro Morone, and Akihiro Kusumi.
  • 雑誌名: Mol. Biol. Cell 巻: 27 ページ: 1101-1119
  • DOI: 10.1091/mbc.E15-04-0186
  • 査読あり
• [学会発表] 1分子観察によるガングリオシドのクラスター形成機構とEGF受容体活性制御機構の解明 (2017)
  • 著者名/発表者名: 鈴木健一
  • 学会等名: 新学術領域研究「神経糖鎖生物学」最終班会議
  • 発表場所: JPタワー名古屋
  • 年月日: 2017-03-03 – 2017-03-04
  • 招待講演
• [学会発表] 高精度1分子観察で初めて明らかになった細胞膜構造とシグナル伝達機構 (2017)
  • 著者名/発表者名: 鈴木健一
  • 学会等名: 第３回医薬獣連携研究会プログラム
  • 発表場所: 岐阜薬科大学
  • 年月日: 2017-01-27
  • 招待講演
• [学会発表] Regulation mechanisms of EGF receptor activity by gangliosides as revealed by single-molecule imaging (2016)
  • 著者名/発表者名: Kenichi G. N. Suzuki
  • 学会等名: The 8th Asian Community for Glycoscience and Glycotechnology
  • 発表場所: Jiangnan University, Wuxi, China
  • 年月日: 2016-10-13 – 2016-10-16
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 1分子イメージングにより明らかになったガングリオシドの糖鎖相互作用によるEGF受容体活性制御機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 鈴木健一
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会2016年大会
  • 発表場所: 北里大学
  • 年月日: 2016-07-28 – 2016-07-29
  • 招待講演
• [学会発表] Unraveling of raft organization and function by single-molecule imaging of new ganglioside probes (2016)
  • 著者名/発表者名: Kenichi G. N. Suzuki
  • 学会等名: The 21st iCeMS International Symposium
  • 発表場所: Kyoto University, Kyoto
  • 年月日: 2016-06-03 – 2016-06-04
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考] 脂質の挙動をありのままに再現する蛍光プローブでラフトの形成機構を解明
  • URL: http://www.icems.kyoto-u.ac.jp/ja/news/3598
• [備考] 新しい糖脂質蛍光プローブを開発して細胞膜の"筏ナノドメイン"を解明
  • URL: https://www.icems.kyoto-u.ac.jp/ja/news/2732