| 研究領域 | 新生鎖の生物学 |
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| 研究課題/領域番号 |
17H05671
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
山下 暁朗 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (20405020)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | アミノ酸飢餓 / 翻訳 / リボソーム / 新生鎖 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、飢餓アミノ酸コドン上で停滞したリボソームにおける新生鎖の運命を解明することを目的に、SMG1とプロテアソーム、TRiC複合体を基軸として解析を進めた。
1)アミノ酸飢餓ストレスにより停滞したリボソーム上の新生鎖の運命の解析:
アミノ酸飢餓により停滞したリボソーム上の新生鎖を簡便に解析するため、レポーターとして、飢餓アミノ酸を置換したNanoLucを作成し、解析した。その結果、NanoLucの活性が野生型の1/1000~1/20000となり、使用可能ではあるが、最適ではないこと明らかとなった。そのため、新たに発表された、HiBit(Split-NanoLucペプチド)に飢餓アミノ酸コドン（KVPE）を含まないmutant-T4-Lysozyme (mT4L)を融合させたタンパク質に飢餓アミノ酸コドン、自己開裂ペプチド、Halo-Tagを配置したレポーターを設計した。HiBitペプチドはリジンを含むため、これをアルギニンに置換した改変HiBitを作成し、解析した結果、オリジナルの物よりも高い活性が得られた。このレポーターをeGFP-rpL10a融合タンパク質を判定発現する細胞へ導入すべくレンチウイルスベクターの作成を進めている。これを用いて、GFP抗体ビーズ胃より精製したリボソームと共精製されるHiBitペプチド新生鎖の存在量をLgBitを含むアッセイキットにより測定することで定量化することで、アミノ酸飢餓ストレスにおける新生鎖の運命を解析する予定としている。
2)アミノ酸飢餓ストレスにおける新生鎖の運命決定に対するSMG1機能の解析:
ペプチドアレイを用いてSMG1の基質特異性を解析した結果を基に、in-silico解析を行った。その結果、SMG1の基質候補として2つのプロテアソームサブユニットと1つのTRiC構成因子を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アミノ酸飢餓ストレスにおける新生鎖の運命を解析するため、レポーターとして、飢餓アミノ酸を置換したNanoLucを使用可能か解析した結果、野生型の1/1000~1/20000の活性であった。そこで、新規に開発されたSplit Nano luciferaseであるHiBit-LgBit systemを改変し、使用することにより、飢餓アミノ酸コドン（KVPE）を含まないレポーターの作成に成功した。レポーター安定発現細胞作成のためのレンチウイルスベクター作成に手間取ったが、問題は解決している。また、SMG1と新生鎖の関わりを解析するための基質候補探しについても、ペプチドアレイを用いたSMG1基質特異性解析とin-silico解析により候補の絞り込みに成功した。
以上より、研究はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
1)アミノ酸飢餓ストレスにより停滞したリボソーム上の新生鎖の運命の解析:
アミノ酸飢餓により停滞したリボソーム上の新生鎖を簡便に解析するために作成したレポーターを安定発現する細胞株を樹立する。昨年度設計・作成中のレポーターは改変型HiBit(Split-NanoLucペプチド)に飢餓アミノ酸コドン（KVPE）を含まないmutant-T4-Lysozyme (mT4L)を融合させたタンパク質に飢餓アミノ酸コドン、自己開裂ペプチド、Halo-Tagを配置した。このレポーターとeGFP-rpL10a融合タンパク質を判定発現する細胞を樹立する。これを用いて、GFP抗体ビーズ胃より精製したリボソームと共精製されるHiBitペプチド新生鎖の存在量をLgBitを含むアッセイキットにより測定することで定量化する。この系を用いて、アミノ酸飢餓ストレスにおける新生鎖の運命を解析する。
2)アミノ酸飢餓ストレスにおける新生鎖の運命決定に対するSMG1機能の解析:
1)で作成・改善したレポーターを用いて、SMG1 knockdownや阻害剤を用いた解析により、アミノ酸飢餓やNMDにおける新生鎖の運命にSMG1が関わるかを明らかにする。また、ペプチドアレイを用いてSMG1の基質特異性を解析した結果を基に、in-silico解析を行った。その結果、SMG1の基質候補として2つのプロテアソームサブユニットと1つのTRiC構成因子を同定している。これらのリコンビナントタンパク質やペプチドを用いて、SMG1によるリン酸化とその意義を解析する。さらに、アミノ酸飢餓ストレス以外のリボソーム停滞を誘導する刺激（プロテアソーム阻害、VCP阻害、UVなど）における新生鎖の運命とSMG1との関わりについても解析を進める。
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