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2018 年度 実績報告書

膜タンパク質複合体の成熟化過程をin vivo活写する

公募研究

研究領域動的構造生命科学を拓く新発想測定技術-タンパク質が動作する姿を活写する-
研究課題/領域番号 17H05879
研究機関京都大学

研究代表者

森 博幸  京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (10243271)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2019-03-31
キーワードIn vivo光架橋実験 / PiXie / VemP / SecDF / LptDE / pBPA
研究実績の概要

細胞質外で働くタンパク質は、リボソームによる合成→細胞質膜へのtargeting→膜透過→folding/assemblyと言った複数の過程を経て成熟化する。生細胞内では、個々の反応は独立にシークエンシャルに起こるのではなく、複数の過程が部分的に重複しながら協調的に進む。反応を素過程に分けて解析するin vitro実験系では、タンパク質成熟化の全体像を正しく理解することは難しい。それ故、タンパク質の成熟過程をin vivoで直接追跡し評価できる実験系を構築する必要がある。我々は、膜タンパク質SecYを用いた解析を通して、「部位特異的in vivo光架橋法が、一過的かつ動的なタンパク質間相互作用を高い空間分解能で検出できる優れた方法である。」ことを明らかにした。本研究では、「部位特異的in vivo光架橋実験」を「pulse-chase実験」と組み合わせ、生細胞内で秒単位のタンパク質間相互作用変化を検出・追跡できる高時間・高空間分解能を持つ実験システム (PiXie法と命名)を構築し、in vivoでのタンパク質の成熟化を含めた動態解析を行うことを目指す。昨年の研究により、超強力UV照射装置SP-9(ウシオ電機製)を用いることにより、僅か1秒のUV照射で効率良い架橋形成が可能であることを明らかにし、PiXie法を用いた解析により膜タンパク質のfolding/assembly過程を追跡できることを示した。本年度は、分泌タンパク質VemP新生鎖の成熟化と局在化を本手法を用いて追跡し、成熟化の過程で生じる細胞内因子との架橋形成に成功した。本実験手法の有効性が強く示唆された。更に、部位特異的in vivo光架橋法とPiXie法を用いた研究をまとめたreviewを執筆した。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 3件)

  • [雑誌論文] A photo-cross-linking approach to monitor protein dynamics in living cells2019

    • 著者名/発表者名
      Miyazaki Ryoji、Akiyama Yoshinori、Mori Hiroyuki
    • 雑誌名

      Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects

      巻: in press ページ: in press

    • DOI

      10.1016/j.bbagen.2019.03.003

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Heat shock transcription factor σ<sup>32</sup> defective in membrane transport can be suppressed by transposon insertion into genes encoding a restriction enzyme subunit or a putative autotransporter in <i>Escherichia coli</i>2018

    • 著者名/発表者名
      Yura Takashi、Miyazaki Ryoji、Fujiwara Keigo、Ito Koreaki、Chiba Shinobu、Mori Hiroyuki、Akiyama Yoshinori
    • 雑誌名

      Genes & Genetic Systems

      巻: 93 ページ: 229~235

    • DOI

      10.1266/ggs.18-00040

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Monitoring substrate enables real-time regulation of a protein localization pathway2018

    • 著者名/発表者名
      Ito Koreaki、Mori Hiroyuki、Chiba Shinobu
    • 雑誌名

      FEMS Microbiology Letters

      巻: 365 ページ: 無し

    • DOI

      10.1093/femsle/fny109

    • 査読あり
  • [学会発表] Identification and characterization of a translation arrest motif in VemP by systematic mutational analysis.2018

    • 著者名/発表者名
      Mori, H., Sakashita, S., Ito, J., Ishii, E. and Akiyama Y.
    • 学会等名
      International Symposium on “Proteins; from the Cradle to the Grave”
    • 国際学会
  • [学会発表] Analysis of cis and trans factors involved in export and translation arrest of VemP by an in vivo photo cross-linking approach.2018

    • 著者名/発表者名
      Miyazaki, R., Akiyama Y. and Mori, H.
    • 学会等名
      International Symposium on “Proteins; from the Cradle to the Grave”
    • 国際学会
  • [学会発表] Roles of mRNA secondary structure of vemP-secD2 intergenic region in VemP translation arrest coupled SecD2 expression2018

    • 著者名/発表者名
      Ishii, E., Sakashita, S., Akiyama, Y. and Mori, H.
    • 学会等名
      International Symposium on “Proteins; from the Cradle to the Grave”
    • 国際学会
  • [学会発表] SRP経路を介したVemPの膜透過装置への輸送と翻訳アレスト解除.2018

    • 著者名/発表者名
      宮崎亮次、秋山芳展、森 博幸
    • 学会等名
      第5回ribosome meeting

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公開日: 2019-12-27  

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