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2017 年度 実績報告書

ヒト化マウス作製技術により明らかにする脳神経系発生発達多様性の分子的基盤

公募研究

研究領域多様な「個性」を創発する脳システムの統合的理解
研究課題/領域番号 17H05967
研究機関国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター

研究代表者

井上 由紀子  国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所 疾病研究第六部, 科研費研究員 (30611777)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2019-03-31
キーワードヒト化マウス / オキシトシン受容体 / CRISPR/Cas9 / ゲノム編集 / 遺伝子改変マウス
研究実績の概要

「個性」を客観的・科学的に理解することを目指す本領域の中で、本研究では「個性」の客観的指標のひとつとなりうるautistic-like traits(閾値下の自閉症的行動特性)に関わる遺伝子座に着目し、ゲノム編集技術を駆使して「ヒト化マウス」を作製する。これは、ヒトでは計測できないゲノム改変による脳活動・行動様式の変化を検証可能な齧歯類モデルとして有用であると期待される。
本研究ではオキシトシン受容体遺伝子座に着目している。神経伝達物質としてのオキシトシンは、脳内に広く分布するオキシトシン受容体を介して社会性行動に関わることが知られているが、受容体蛋白質に対する高い特異性を持つ抗体が市販されておらず、また、mRNAの分布を検出するin situ hybridization法も複数の研究室で試されたが成功していないため、そもそも、マウス脳内での受容体発現パターンを正確に把握する必要があった。このような場合、自己切断ペプチド2Aを利用して、標的遺伝子と共にGFP/RFPなどの蛍光蛋白質を発現させるノックインマウスが有効である。今年度は、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、オキシトシン受容体遺伝子座に2A-EGFPあるいは2A-(多重化RFP)を挿入したノックインマウス作出に成功し、内在性受容体発現を明瞭に可視化することができた。また、ゲノム編集とBAC(細菌人工染色体)を併用して、マウス・オキシトシン受容体遺伝子をノックアウトすると同時に、ヒト・オキシトシン受容体遺伝子座を丸ごとノックインする「ヒト化マウス」作製も進めている。
以上のような研究に加えて、領域内の技術支援として、マウス受精卵を用いたゲノム編集による遺伝子改変マウス作製を多数行い、連携研究者へ提供した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

社会性行動に関わる遺伝子座として、オキシトシン受容体遺伝子に着目し、ゲノム編集によりノックインマウスを作製して、脳内での受容体発現パターンの可視化に成功した。また、マウス遺伝子をノックアウトすると同時にヒト遺伝子を丸ごとノックインして、ヒト型プロモーター・エンハンサーによる遺伝子発現制御を保持する「ヒト化マウス」作製にも取り組んでいる。今年度は、論文報告があるヒトBACノックイン法を試したが、効率が悪く、ヒト化マウス作出には至らなかった。
一方で、領域内の技術支援として、マウス受精卵を用いたゲノム編集による遺伝子改変マウス作製を多数行い、連携研究者へ順調に提供できている。

今後の研究の推進方策

オキシトシン受容体遺伝子座を「ヒト化」したマウス作製については、現在、ヒト BACをベースとして新たな方法でターゲティングベクター作製に取り組んでいる。また、マウス受精卵内でより効率良くゲノム編集を行うために、CRISPR/Cas9ツールを受精卵に導入後、数日間培養した胚盤胞を用いてゲノム切断効率を調べ、最もよく切れるCRISPRツールを予め選んでおくことにより、ヒト化マウス作製を進める。
以上のような研究に加えて、引き続き、領域内の連携研究者の要望に応じて、マウス受精卵を用いたゲノム編集による遺伝子改変マウス作製を行い、提供する。

  • 研究成果

    (14件)

すべて 2018 2017 その他

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (10件) (うち国際学会 2件) 備考 (2件)

  • [雑誌論文] Meis1 Coordinates Cerebellar Granule Cell Development by Regulating Pax6 Transcription, BMP Signaling and Atoh1 Degradation2018

    • 著者名/発表者名
      Owa Tomoo、Taya Shinichiro、Miyashita Satoshi、Yamashita Mariko、Adachi Toma、Yamada Koyo、Yokoyama Miwa、Aida Shogo、Nishioka Tomoki、Inoue Yukiko U.、Goitsuka Ryo、Nakamura Takuro、Inoue Takayoshi、Kaibuchi Kozo、Hoshino Mikio
    • 雑誌名

      The Journal of Neuroscience

      巻: 38 ページ: 1277~1294

    • DOI

      https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1545-17.2017

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Generation of Pax6-IRES-EGFP knock-in mouse via the cloning-free CRISPR/Cas9 system to reliably visualize neurodevelopmental dynamics2018

    • 著者名/発表者名
      Inoue Yukiko U.、Morimoto Yuki、Hoshino Mikio、Inoue Takayoshi
    • 雑誌名

      Neuroscience Research

      巻: in press ページ: in press

    • DOI

      https://doi.org/10.1016/j.neures.2018.01.007

    • 査読あり
  • [学会発表] Visualization and humanization of oxytocin receptor expressions in mice; towards the clinical application of oxytocin to autism spectrum disorders2018

    • 著者名/発表者名
      Yukiko U. Inoue, Yuki Morimoto, Takayoshi Inoue
    • 学会等名
      第9回武田科学振興財団薬科学シンポジウム Genome Editing Towards Medicinal Applications
  • [学会発表] Easi-CRISPRによるノックインマウスを用いたオキシトシン受容体発現の可視化2018

    • 著者名/発表者名
      井上(上野)由紀子、森本由起、井上高良
    • 学会等名
      第11回神経発生討論会
  • [学会発表] Generation of Pax6-IRES-EGFP knock-in mouse via cloning-free CRISPR/Cas9 system for neurodevelopmental researches2017

    • 著者名/発表者名
      Yukiko U. Inoue, Mikio Hoshino, Takayoshi Inoue
    • 学会等名
      Society for Neuroscience 47th annual meeting
    • 国際学会
  • [学会発表] Generation of mouse models for muscular dystrophic chicken by CRISPR/Cas9-mediated genome editing.2017

    • 著者名/発表者名
      Michihiro Imamura, Yukiko U. Inoue, Takayoshi Inoue, Shin’ichi Takeda
    • 学会等名
      米国細胞生物学会
    • 国際学会
  • [学会発表] Analyses of Cyclin D2 mRNA transportation in the cortical development using CRISPR/Cas9 genome editing system2017

    • 著者名/発表者名
      Takako Kikkawa, Yukiko U Inoue, Takayoshi Inoue, Cristine Rosales Casingal, Noriko Osumi
    • 学会等名
      第60回日本神経化学会大会
  • [学会発表] Analyses of Cyclin D2 mRNA transportation mechanism in radial glial cells during corticogenesis using CRISPR/Cas9 genome editing system2017

    • 著者名/発表者名
      Takako Kikkawa, Yukiko U Inoue, Takayoshi Inoue, Noriko Osumi
    • 学会等名
      第40回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] 核酸医薬の網羅的スクリーニングを可能にするEGFP-レポーターアッセイ系の開発2017

    • 著者名/発表者名
      原裕子、永田哲也、井上-上野由紀子、宮武正太、滝澤歩武、溝部吉高、瀬戸美也子、倉岡睦季、井上高良、武田伸一、青木吉嗣
    • 学会等名
      第40回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] CRISPR/Cas9を用いた Musculocontractural Ehlers-Danlos Syndrome-CHST14ノックアウト マウスの作製と病態解析2017

    • 著者名/発表者名
      笠原(仁田原) 優子、島津 苑子、増田 千明、積田 奈々、水本 秀二、井上(上野) 由紀子、井上 高良、吉 沢 隆浩、高橋 有希、池上 良、中山 淳、武田 伸一、渡邉 淳、古庄 知己、岡田 尚巳
    • 学会等名
      第40回日本分子生物学会年会
  • [学会発表] 「個性」創発研究のための『ゲノム編集マウス』作製と解析2017

    • 著者名/発表者名
      井上-上野由紀子、佐藤大気、河田雅圭、金子涼輔、森本由起、浅見淳子、星野幹雄、井上高良
    • 学会等名
      次世代脳プロジェクト 冬のシンポジウム2017
  • [学会発表] CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術による遺伝子改変マウスの作製2017

    • 著者名/発表者名
      井上(上野)由紀子
    • 学会等名
      第二回 新学術領域「個性創発脳」若手の会・技術支援講習会
  • [備考] 「個性」創発脳、CRISPR/Cas9ゲノム編集による遺伝子改変マウス作製支援

    • URL

      http://www.koseisouhatsu.jp/research/support/inoue/index.html

  • [備考] 国立精神・神経医療研究センター 疾病研究第六部 第二研究室

    • URL

      https://www.ncnp.go.jp/nin/guide/r6/index-lab2/index.html

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公開日: 2018-12-17  

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