| 研究実績の概要 |
本研究では、cDNA display 法が持つ分子夾雑環境下での淘汰に対するポテンシャルに着目し、標的分子を夾雑環境下において非固定化条件下で認識するペプチドアプタマーの進化的取得方法の開発を目指している。前年度の研究では、DNAタグを用いてリガンド（＝cDNA display分子）・タンパク質間の結合依存的な光架橋を溶液中で形成させる事が可能であることを、streptavidinをモデル標的タンパク質として示した。本年度はこれに引き続き、別のタンパク質と結合ペプチドの組合せでも同様に光架橋が形成されることを確認した。さらにこの光架橋反応が分子夾雑下でも起こることも確かめ、投稿論文としてオープンアクセス誌Moleculesの分子夾雑特集号に発表した（Molecules, 2020, 25, 1472）。
一方、「cDNA displayを用いた分子夾雑系中での淘汰実験」については、10残基程度の環状ランダムペプチド配列をコードするcDNA displayライブラリを調製し、化学架橋により環化を行った。これを精製した後、標的タンパク質と反応させて親和性のある分子を選択した。セレクションの際はサンプルを2つに分け、通常の緩衝液だけでなく血清を添加した環境でも結合実験を行った。これを何度か繰り返し、「緩衝液セレクション」と「血清セレクション」の夫々に対して次世代シークエンスにより配列解析および上位配列の結合評価を実施したところ、血清を用いたセレクションの方が配列の収束速度や特異性が向上している可能性が示唆された。この事は、当初の作業仮説通り、分子夾雑環境下で試験管内淘汰実験を行う事の有用性およびcDNA display法の優位性を支持していると考えられる。
|
