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相同性依存的修復はDNA二重鎖の切断に応答するDNA修復機構であり、その正確性は染色体安定性にきわめて重要である。類似するが同一でない配列間の相同性依存的修復は中間体にミスマッチを生じるが、ミスマッチ修復機構はこのミスマッチを手がかりに類似配列間の相同性依存的修復を抑制し、正しい配列間の修復を促進する。本研究では、この反応の分子メカニズムを、ツメガエル卵抽出液を用いた試験管内反応系と次世代シーケンス技術を活用した塩基配列情報の取得を組み合わせて解明することを目指した。本年度は先年度に引き続き類似配列間での相同性依存的修復によって生じるミスマッチ塩基の運命について解析を進め、二重鎖切断部位の3′末端に近いほどミスマッチの修正効率が高くなること、ミスマッチの修復は大部分MutSαミスマッチセンサー複合体に依存すること、などを明らかにした。さらに、修復中間体DNAの5′および3′末端を網羅的に特定するために、末端のラベル法、ライブラリ構築の方法などを検討し、実験系の構築を進めた。3′末端のラベリングについてはTdTによるホモポリマー付加が有効であり、これによって効率よく末端を特定することが可能であると分かった。本年度は反応に関与する制御因子、酵素活性因子の解析も進め、ツメガエル卵抽出液からの免疫除去と加え戻しによって主たるヘリカーゼを確定し、さらに変異体を作って反応に必要な機能モチーフを同定した。成果の主要部分については論文として発表する準備を進めている。またヘリカーゼの制御機構については新しいプロジェクトに発展する可能性があり、詳細な検討を進めている段階である。
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