| 研究領域 | 共鳴誘導で革新するバイオイメージング |
|---|
| 研究課題/領域番号 |
18H04748
|
|---|
| 研究機関 | 生理学研究所 |
|---|
研究代表者 |
村越 秀治 生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 准教授 (90608142)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | 蛍光タンパク質 / フェルスター共鳴エネルギー移動 / 蛍光寿命イメージング |
|---|
| 研究実績の概要 |
組織浸透性の高い長波長に最適化された新規“無蛍光”赤色蛍光タンパク質を開発し、2光子蛍光寿命イメージングによる組織内神経細胞内分子活性化イメージングに応用することが本研究の目的である。現在までに、赤色蛍光タンパク質であるmRFP、或いはmCherryを鋳型にし、Error-prone PCRによるランダム変異導入により、吸収はあるが量子収率がほぼ0の無蛍光赤色蛍光タンパク質（ShadowR）の開発に成功した。特に、変異導入にあたって、側鎖が外側に向いているアミノ酸をより親水性のものに置換することによって、細胞内タンパク質への非特異的結合を減らすことができた。また、作製したプロトタイプのShadowRの細胞発現効率を生化学的に調べ、さらに、吸収・発光スペクトルやフォールディング効率等の各種パラメータを計測し性能評価を行った。また、mRuby2（FRETのドナー）とShadowR（アクセプター）のペアを既出のFRETプローブ（CaMKII、Ras、LOV2）に応用することで発現効率やシグナルの大きさ・安定性が優れていることを確認した。現在論文を改定中であり、今年度の出版を目指す。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
新規開発のShadowRの作製に成功した。概要で述べたように、既存の赤色蛍光タンパク質を鋳型にし、Error-prone PCRによるランダム変異導入により、吸収はあるが量子収率がほぼ0の無蛍光赤色蛍光タンパク質（ShadowR）の開発を進めた。特に、変異導入にあたって、側鎖が外側に向いているアミノ酸をより親水性のものに置換することによって、細胞内タンパク質への非特異的結合を減らすことができた。また、生化学的アッセイや、吸収・発光特性の解析、生きた細胞内でのFRETプローブの特性の解析も済み、現在論文を改定中である。研究は極めて順調に進んでいる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
FRETプローブのアデノ随伴ウイルスを作製し、海馬スライスを用いてShadowRの性能を評価する。スライスでの評価がうまく行った場合には個体マウスにプローブを発現させ、2光子蛍光寿命イメージングを行う。このようにして、Ca2+パターンとCaMKII活性化を同時観察することによりその関係を明らかにする。
|
