オーキシンによる多能性幹細胞形成機構の解明

2018 年度 実績報告書

• 研究領域: 植物の生命力を支える多能性幹細胞の基盤原理
• 研究課題/領域番号: 18H04836
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 西浜 竜一 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (70283455)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 全能性 / 多能性 / 幹細胞新生 / ゼニゴケ / オーキシン / 頂端細胞

研究実績の概要

苔類ゼニゴケでは、胞子発芽体から幹細胞である頂端細胞が新生し形態形成が始まることから、胞子発芽体細胞は分化全能性状態、頂端細胞は分化多能性状態にあると言える。オーキシン受容体TIR1の変異体の解析から、核オーキシン信号伝達経路が分化全能性状態から多能性状態への移行に関与する可能性が示唆された。また、被子植物で幹細胞化抑制機能をもつ2種の酵素遺伝子AMP1およびCYP78のゼニゴケ変異体は、弱い器官分化能を有した多能性幹細胞塊となり、オーキシン低感受性を示す。上記変異体での遺伝子発現、クロマチン動態などを比較することで、全能性と多能性の実体、および幹細胞新生の分子機構を明らかにすることを目的としている。さらにオーキシン依存性転写因子ARFの幹細胞調節における役割を、協働する転写因子や細胞間相互作用因子にも着目して解明する。
当年度は、ゼニゴケ野生型の胞子発芽体細胞、tir1変異体、amp1変異体、cyp78変異体を用いたRNA-seq解析を行った。オーキシン処理の有無で比較したところ、オーキシン応答性遺伝子の割合は、野生型＞cyp78≒amp1＞tir1となり、cyp78、amp1変異体は野生型より低いオーキシン応答性を示すことがわかった。そのことと細胞塊になる表現型の関係を調べるため、オーキシン応答を促進する遺伝的操作をしたところ、amp1およびcyp78変異が抑圧された。つまりAMP1, CYP78両酵素遺伝子はオーキシン応答の促進物質を生成、あるいは抑制物質を不活化することで幹細胞化を抑制していると考えられた。
ゼニゴケが保持する3つのARFのうち、転写活性化型のARF1と転写抑制型のARF2の発現は、どちらも幹細胞領域で弱く、その周りで強いことがわかった。無性芽発生過程においてARF1とARF2は拮抗的に幹細胞形成を制御することを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

AMP1, CYP78機能とオーキシン応答の関連性についての理解をより深めることができ、変異体の細胞塊の特徴づけが進んだ。幹細胞形成における転写活性化型ARFと転写抑制型ARFの間での拮抗作用を明らかにできたことで、オーキシン応答の精細な調整が幹細胞形成に重要であることを示せただけでなく、ARFの作用機作の解明にも貢献できた。またそれらARFの発現領域の組み合わせパターンが、幹細胞領域、増殖領域、分化領域に対応するという興味深い結果が得られたことも、幹細胞形成機構を考える上で意義深い。
クロマチン状態を調べるためにATAC-seqおよびChIP-seq（あるいはCUT&RUN）を行う計画であった。試薬・試料の入手が遅れたり、解析機器の修理に時間がかかったことにより、プロトコールの確立がずれ込み、実行することができなかったが、次年度には行える見込みである。

今後の研究の推進方策

RNA-seqデータを用いて主成分分析やクラスタリングを行い、tir1変異体、amp1変異体、cyp78変異体における遺伝子発現プロファイルの関係性を明らかにする。また、それぞれの変異体で特徴的に発現している遺伝子を同定し、それらの幹細胞性制御への関与をゲノム編集技術を用いた遺伝学的解析により調べる。また、それらの細胞でATAC-seq解析および修飾ヒストンChIP-seq（あるいはCUT&RUN法）によりオープンクロマチン領域やクロマチン状態の変化を調べ、発現プロファイルと照合することで全能性と多能性を定義づける遺伝子発現状態を明らかにする。さらに、tir1変異体に条件的に活性化できるTIR1コンストラクトを導入し、活性化誘導後に遺伝子発現プロファイルやオープンクロマチン状態がどのように変化するのか調べ、全能性状態から多能性状態に推移する際にどのような変化を伴うか明らかにする。
AMP1およびCYP78によるオーキシン応答調節の仕組みを明らかにする。まず両遺伝子の発現部位を特定する。また、AMP1, CYP78がオーキシン応答経路のどこに作用するのか調べるため、変異体における転写抑制因子Aux/IAAの安定性を調べる。さらに計画班と協力して、両酵素の基質と産物の同定を目指す。
ARF1とARF2の幹細胞領域における発現制御機構を解明する。最近同定した幹細胞領域で特異的に発現するAP2/ERF型転写因子や、幹細胞領域で特徴的な発現をするEPFL-ER細胞間コミュニケーション信号伝達経路との機能的な関連を調べる。

研究成果

• [国際共同研究] Wageningen University(オランダ)
  • 国名: オランダ
  • 外国機関名: Wageningen University
• [国際共同研究] University of Bristol(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: University of Bristol
• [国際共同研究] Universidad Veracruzana, INBIOTECA(メキシコ)
  • 国名: メキシコ
  • 外国機関名: Universidad Veracruzana, INBIOTECA
• [雑誌論文] Control of proliferation in the haploid meristem by CLE peptide signaling in Marchantia polymorpha (2019)
  • 著者名/発表者名: Hirakawa Y, Uchida N, Yamaguchi YL, Tabata R, Ishida S, Ishizaki K, Nishihama R, Kohchi T, Sawa S, Bowman JL
  • 雑誌名: PLOS Genetics 巻: 15 ページ: e1007997
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1007997
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Physiological function of photoreceptor UVR8 in UV-B tolerance in the liverwort Marchantia polymorpha (2019)
  • 著者名/発表者名: Kondou Y, Miyagi Y, Morito T, Fujihira K, Miyauchi W, Moriyama A, Terasawa T, Ishida S, Iwabuchi K, Kubo H, Nishihama R, Ishizaki K, Kohchi T
  • 雑誌名: Planta 巻: 249 ページ: 1349～1364
  • DOI: 10.1007/s00425-019-03090-w
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reproductive Induction is a Far-Red High Irradiance Response that is Mediated by Phytochrome and PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR in Marchantia polymorpha (2019)
  • 著者名/発表者名: Inoue K, Nishihama R, Araki T, Kohchi T
  • 雑誌名: Plant and Cell Physiology 巻: pcz029 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1093/pcp/pcz029
  • 査読あり
• [雑誌論文] Observation of Phototropic Responses in the Liverwort Marchantia polymorpha (2019)
  • 著者名/発表者名: Komatsu A, Nishihama R, Kohchi T
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: 1924 ページ: 53～61
  • DOI: doi: 10.1007/978-1-4939-9015-3_6
  • 査読あり
• [雑誌論文] A cis‐acting bidirectional transcription switch controls sexual dimorphism in the liverwort (2019)
  • 著者名/発表者名: Hisanaga T, Okahashi K, Yamaoka S, Kajiwara T, Nishihama R, Shimamura M, Yamato KT, Bowman JL, Kohchi T, Nakajima K
  • 雑誌名: The EMBO Journal 巻: 38 ページ: e100240
  • DOI: 10.15252/embj.2018100240
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A Single JAZ Repressor Controls the Jasmonate Pathway in Marchantia polymorpha (2019)
  • 著者名/発表者名: Monte I, Franco-Zorrilla JM, Garcia-Casado G, Zamarreno AM, Garcia-Mina JM, Nishihama R, Kohchi T, Solano R
  • 雑誌名: Molecular Plant 巻: 12 ページ: 185～198
  • DOI: 10.1016/j.molp.2018.12.017
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Transcription factor DUO1 generated by neo-functionalization is associated with evolution of sperm differentiation in plants (2018)
  • 著者名/発表者名: Higo A, Kawashima T, Borg M, Zhao M, Lopez-Vidriero I, Sakayama H, Montgomery SA, Sekimoto H, Hackenberg D, Shimamura M, Nishiyama T, Sakakibara K, Tomita Y, Togawa T, Kunimoto K, Osakabe A, Suzuki Y, Yamato KT, Ishizaki K, Nishihama R, Kohchi T, Franco-Zorrilla JM, Twell D, Berger F, Araki T
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 9 ページ: 5283
  • DOI: 10.1038/s41467-018-07728-3
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] An Evolutionarily Conserved Abscisic Acid Signaling Pathway Regulates Dormancy in the Liverwort Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Eklund DM, Kanei M, Flores-Sandoval E, Ishizaki K, Nishihama R, Kohchi T, Lagercrantz U, Bhalerao RP, Sakata Y, Bowman JL
  • 雑誌名: Current Biology 巻: 28 ページ: 3691～3699.e3
  • DOI: 10.1016/j.cub.2018.10.018
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Efficient CRISPR/Cas9-based genome editing and its application to conditional genetic analysis in Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Sugano SS, Nishihama R, Shirakawa M, Takagi J, Matsuda Y, Ishida S, Shimada T, Hara-Nishimura I, Osakabe K, Kohchi T
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 13 ページ: e0205117
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0205117
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Novel gateway binary vectors for rapid tripartite DNA assembly and promoter analysis with various reporters and tags in the liverwort Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Mano S, Nishihama R, Ishida S, Hikino K, Kondo M, Nishimura M, Yamato KT, Kohchi T, Nakagawa T
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 13 ページ: e0204964
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0204964
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ANGUSTIFOLIA contributes to the regulation of three-dimensional morphogenesis in the liverwort Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Furuya T, Hattori K, Kimori Y, Ishida S, Nishihama R, Kohchi T, Tsukaya H
  • 雑誌名: Development 巻: 145 ページ: dev161398
  • DOI: 10.1242/dev.161398
  • 査読あり
• [雑誌論文] Loss of CG methylation in Marchantia polymorpha causes disorganization of cell division and reveals unique DNA methylation regulatory mechanisms of non-CG methylation (2018)
  • 著者名/発表者名: Ikeda Y, Nishihama R, Yamaoka S, Arteaga-Vazquez MA, Aguilar-Cruz A, Grimanelli D, Pogorelcnik R, Martienssen RA, Yamato KT, Kohchi T, Hirayama T, Mathieu O
  • 雑誌名: Plant and Cell Physiology 巻: 59 ページ: 2421～2431
  • DOI: 10.1093/pcp/pcy161
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Identification and Biochemical Characterization of the Serine Biosynthetic Enzyme 3-Phosphoglycerate Dehydrogenase in Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Akashi H, Okamura E, Nishihama R, Kohchi T, Hirai MY
  • 雑誌名: Frontiers in Plant Science 巻: 9 ページ: 956
  • DOI: 10.3389/fpls.2018.00956
  • 査読あり
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-Based Genome Editing of Transcription Factor Genes in Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Sugano SS, Nishihama R
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: 1830 ページ: 109～126
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-8657-6_7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ligand-receptor co-evolution shaped the jasmonate pathway in land plants (2018)
  • 著者名/発表者名: Monte I, Ishida S, Zamarreno AM, Hamberg M, Franco-Zorrilla JM, Garcia-Casado G, Gouhier-Darimont C, Reymond P, Takahashi K, Garcia-Mina JM, Nishihama R, Kohchi T, Solano R
  • 雑誌名: Nature Chemical Biology 巻: 14 ページ: 480～488
  • DOI: 10.1038/s41589-018-0033-4
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] 新しいモデル生物：苔類ゼニゴケ (2018)
  • 著者名/発表者名: 西浜竜一，河内孝之
  • 雑誌名: 領域融合レビュー 巻: 7 ページ: e008
  • DOI: DOI: 10.7875/leading.author.7.e008
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Auxin regulation of meristem formation and maintenance in Marchantia polymorpha (2019)
  • 著者名/発表者名: Nishihama R
  • 学会等名: Mini Symposium on Marchantia
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Connections between apical cell function and auxin response in the liverwort Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Nishihama R, Kohchi T
  • 学会等名: JPR International Symposium "Apical stem cell(s): evolutionary basis for 3D body plans in land plants"
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Cellular reprogramming as a response to the loss of apical dominance in the liverwort Marchantia polymorpha (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishida S, Kojima M, Takebayashi Y, Sakakibara H, Yamaguchi K, Shigenobu S, Yamaoka S, Kohchi T, Nishihama R
  • 学会等名: EMBO Workshop New shores in land plant evolution
  • 国際学会
• [学会・シンポジウム開催] JPR International Symposium "Apical stem cell(s): evolutionary basis for 3D body plans in land plants" (2018)