公募研究
環境内の刺激条件に対応した目標指向行動の学習(刺激弁別学習)は、変化する環境における動物の基本的な行動的適応の一形態であり、主として、大脳皮質―基底核―視床を連関するループ回路によって担われている。我々の研究グループは、独自開発した遺伝子改変技術や細胞標的法を用い、このループ回路の機能解析に取り組んできた。これまでに、刺激弁別行動の実行やルール変更に伴う行動スイッチにおいて、特定の神経回路や、線条体(大脳基底核の入力層に相当する)の数種類のニューロンが果たす役割について報告してきた。しかし、刺激弁別学習はその獲得期・固定化期から始まり、実行期を経て熟練期やルール変更期に至る様々な学習フェーズを含んでいる。線条体の多種多様なニューロンが、それぞれのフェーズにおいて行動を制御する神経機構の詳細はまだ不明な点が多い。我々のグループは、線条体に存在する2種類の投射ニューロン(直接路ニューロンと間接路ニューロン)のそれぞれにおいて特異的にCreを発現するラット(Tac1-CreおよびDrd2-Creラット)の開発に成功した。これにより、刺激弁別の様々な学習フェーズにおいて、線条体投射ニューロンの活動をカルシウムイメージングにより可視化し、タイプ間およびフェーズ間の比較を通じて、その詳細な機能解析を進めることが可能となった。本年度は、上記ラットとウィルスベクターを併用し、直接路と間接路のそれぞれの投射ニューロン特異的なカルシウムプローブを発現誘導する実験系を確立した。同時に、極微細蛍光内視鏡イメージングシステムをラットの線条体に適用し、光学装置,ソフトウェア,および定位脳手術の方法を検討し、麻酔下ラットの直接路投射ニューロンのイメージングに成功した。さらに、in vivoイメージングに適したラット用の聴覚刺激弁別タスクの訓練プロトコールを確立した。
2: おおむね順調に進展している
線条体投射ニューロンサブタイプ特異的なカルシウムプローブの発現誘導:カルシウムプローブGCaMP6fをCre依存的に発現誘導するAAVベクター(DJタイプ)を作成し、Tac1-Creラット、あるいはDrd2-Creラットの線条体に微少注入し、直接路投射ニューロンあるいは間接路投射ニューロンに特異的な導入遺伝子発現が誘導されていることを確認した。In vivoカルシウムイメージングのために、共同研究者(大阪大学・小山内実博士ら)が開発した極微細蛍光内視鏡イメージングシステムを導入し、ソフトウェアとして、NIH imgage Jおよび浜松ホトニクスのHC imageの有用性を確認した。ラット線条体へのGRINレンズの刺入・留置手術の方法を検討した。これらの方法論が有機的に結び付き、効率的なカルシウムイメージングが実現できていることを、麻酔下のラット(Tac1-Cre)の直接路投射ニューロンのイメージングを通じて確認した。また、In vivoカルシウムイメージングの適用可能なラットの聴覚刺激弁別タスクのために、実験試行をセルフスタートし、行動選択の直前まで凝視点を見つめる、というサルのin vivo電気生理実験を参考に、同様の事態をラットでも実現するための新たな聴覚刺激弁別タスクの開発を行い、速やかに弁別が獲得される(弁別課題開始後4~5日で80%以上の正反応率に到達)タスクの訓練プロトコールを確立した。
上記のように、R1年度の検討を通じて、本研究が立脚する様々な方法論、分子遺伝学的ツール・極微細蛍光内視鏡イメージングシステムの最適化・ラットの行動課題、については一定の完成をみた。T次年度は、聴覚刺激弁別を獲得し、安定的に実行できるまで訓練したラットを用い、弁別実行時の線条体投射ニューロンのin vivoイメージングを実現させる。これと並行して、取得したデータの解析方法について、検討を加える。さらなる発展として、Tac1-Cre(直接路投射ニューロン)とDrd2-Cre(間接路投射ニューロン)の活動の比較や学習の実行フェーズだけでなく、獲得やルール変更フェーズへのイメージングの展開も計画している。
すべて 2019
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Frontiers in Cellular Neuroscience
巻: 13 ページ: 547
10.3389/fncel.2019.00547