シナプス伝達制御と中枢ー末梢機能連関から捉える意志動力学

2019 年度 実績報告書

• 研究領域: 「意志動力学（ウィルダイナミクス）の創成と推進」に関する総合的研究
• 研究課題/領域番号: 19H05014
• 研究機関: 山梨大学
• 研究代表者: 大塚 稔久 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (40401806)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: シナプス / オキシトシン / CAST / ELKS

研究実績の概要

これまで、ストレス関連脳領域や末梢組織におけるCAST、ELKSの発現や役割に関する詳細な研究は行われてなかったことから、本年度はまず、プレシナプス分子CASTおよびELKSのストレス関連脳領域、末梢組織における基礎的なデータを固めるため、mRNA、タンパク質の発現の確認解析を行った。まず、全脳領域での発現パターンを調べるため、CAST, ELKSをそれぞれ特異的に検出するfluorescence in situ hybridization (FISH) や免疫組織染色 (IHC) を行った。その結果ELKSは小脳顆粒細胞においてmRNAが顕著に強く発現し、そのタンパク質は小脳分子層に分布しているのに対し、CASTはmRNAもタンパク質も脳内に幅広く発現していることが分かった。続いて、ストレスに関連する部位について詳細に調べたところ、ホルモン分泌中枢である脳下垂体では、ストレス関連ホルモンACTHを放出する前葉ではCASTではなく、ELKSタンパク質が発現しており、副腎においてもELKSのみ発現していることが明らかとなった。これに対し、ストレス応答回路である視床下部室傍核―延髄腹外側部ではELKSではなく、CASTのmRNAの発現が確認された。これらの結果はCASTとELKSはファミリー分子ではあるが、ストレス応答に関しては異なる役割を果たす可能性が示唆された。続いて、ストレスに応答した神経細胞を検出するため、最初期遺伝子c-Fosの発現をFISHで検出する系の確立を行った。マウスに対し30分の拘束ストレスを行うと、視床下部室傍核においてc-Fosの発現が顕著に増加した。また、CASTとc-Fosの二重FISH染色の結果、室傍核のCAST陽性細胞のうち約30％の細胞が拘束ストレスにおいて活性化することが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ストレス関連領域を対象にCAST、ELKSの発現解析を行った結果、脳内ストレス応答領域である視床下部室傍核や延髄腹外側部ではCASTが発現し、脳下垂体前葉、副腎ではELKSが発現するという2つのファミリー分子がストレス関連領域において大きく異なる発現様式を持つことが明らかとなった。また、脳下垂体の発現解析についてはCAST KOの母マウスの養育行動異常を報告する論文として報告した (Sci. Report, 2020, Hagiwara et al.)。さらに、c-Fos mRNAをマーカーとして、拘束ストレス時に活性化した神経細胞を検出する系も確立できた。c-Fosが増加した視床下部室傍核ではCASTの発現も高いことが分かったため、室傍核からのストレス情報の伝達において、CASTが何らかの役割を持つ可能性が示唆された。
以上の成果から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

ストレスによる動物個体への影響を調べる実験系の確立を目指す。具体的には血糖、もしくはカテコールアミンといった生体マーカーをELISA等により測定する生理学的な実験系と、高架式十字迷路、オープンフィールド試験、ショ糖嗜好性試験等の気分・不安障害の動物行動学に基づいた実験系によりストレスの影響を評価する。実験系が確立されたのちには、CAST/ELKS floxマウスにc-FosプロモーターでCreERT2が発現するAAVを感染させることにより、ストレスに応答する神経細胞特異的にCAST/ELKSの発現を欠失させる。その後のストレスを与え、前述の生体マーカーの測定や、行動実験により評価していくことにより、ストレス制御におけるCAST/ELKSの機能を検討する。副腎髄質へDREADD発現AAVを感染させ、薬剤投与によるカテコールアミン分泌制御によるストレス応答脳領域でのシナプス可塑性への影響を検討する。同様の実験系をCAST/ELKS cKOマウスを用いてストレス刺激による、シナプス可塑性の変化、動物行動の変化におけるCAST/ELKSの役割を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Presynaptic development is controlled by the core active zone proteins CAST/ELKS. (2020)
  • 著者名/発表者名: Radulovic, T., Dong, W., Goral, R., Thomas, C., Veeraraghavan, P., Montesinos, M., Guerrero-Given, D., Goff, K., Luebbert, M., Kamasawa, N., Ohtsuka, T., Young, S.M.*
  • 雑誌名: J. Physiol. 巻: in press ページ: -
  • DOI: 10.1113/JP279736.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Impaired experience-dependent maternal care in presynaptic active zone protein CAST-deficient dams (2020)
  • 著者名/発表者名: Hagiwara, A., Sugiyama, N., Ohtsuka, T.*
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 5238
  • DOI: 10.1038/s41598-020-62072-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CAST/ELKS in the mouse forebrain causes high mortality of newborn pups. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hagiwara, A., Hamada, S., Hida, Y., Ohtsuka, T.*
  • 雑誌名: Molecular Brain 巻: 13 ページ: 13
  • DOI: 10.1186/s13041-020-0557-x.2019.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] VPS13D ‐related disorders presenting as a pure and complicated form of hereditary spastic paraplegia (2019)
  • 著者名/発表者名: Koh Kishin、Ishiura Hiroyuki、Shimazaki Haruo、Tsutsumiuchi Michiko、Ichinose Yuta、Nan Haitian、Hamada Shun、Ohtsuka Toshihisa、Tsuji Shoji、Takiyama Yoshihisa
  • 雑誌名: Molecular Genetics & Genomic Medicine 巻: 8 ページ: e1108
  • DOI: 10.1002/mgg3.1108
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] UBAP1 mutations cause juvenile-onset hereditary spastic paraplegias (SPG80) and impair UBAP1 targeting to endosomes (2019)
  • 著者名/発表者名: Nan Haitian、Ichinose Yuta、Tanaka Masaki、Koh Kishin、Ishiura Hiroyuki、Mitsui Jun、Mizukami Heisuke、Morimoto Masafumi、Hamada Shun、Ohtsuka Toshihisa、Tsuji Shoji、Takiyama Yoshihisa
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 64 ページ: 1055～1065
  • DOI: 10.1038/s10038-019-0670-9
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Role of the active zone protein, ELKS, in insulin secretion from pancreatic β-cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohara-Imaizumi Mica、Aoyagi Kyota、Ohtsuka Toshihisa
  • 雑誌名: Molecular Metabolism 巻: 27 ページ: S81～S91
  • DOI: 10.1016/j.molmet.2019.06.017
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Vangl2 interaction plays a role in the proteasomal degradation of Prickle2 (2019)
  • 著者名/発表者名: Nagaoka Tadahiro、Furuse Mikio、Ohtsuka Toshihisa、Tsuchida Kunihiro、Kishi Masashi
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 2912
  • DOI: 10.1038/s41598-019-39642-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] ELKS/Voltage-Dependent Ca2+ Channel-β Subunit Module Regulates Polarized Ca2+ Influx in Pancreatic β Cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohara-Imaizumi Mica、Aoyagi Kyota、Yamauchi Hajime、Yoshida Masashi、Mori Masayuki X.、Hida Yamato、Tran Ha Nam、Ohkura Masamichi、Abe Manabu、Akimoto Yoshihiro、Nakamichi Yoko、Nishiwaki Chiyono、Kawakami Hayato、Hara Kazuo、Sakimura Kenji、Nagamatsu Shinya、Mori Yasuo、Nakai Junichi、Kakei Masafumi、Ohtsuka Toshihisa
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 26 ページ: 1213～1226.e7
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2018.12.106
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Neuroimaging, genetic, and enzymatic study in a Japanese family with a GBA gross deletion (2019)
  • 著者名/発表者名: Ichinose Yuta、Ishiura Hiroyuki、Tanaka Masaki、Yoshimura Jun、Doi Koichiro、Umeda Takako、Yamauchi Hajime、Tsuchiya Mai、Koh Kishin、Yamashiro Nobuo、Mitsui Jun、Goto Jun、Onishi Hiroshi、Ohtsuka Toshihisa、Shindo Kazumasa、Morishita Shinichi、Tsuji Shoji、Takiyama Yoshihisa
  • 雑誌名: Parkinsonism & Related Disorders 巻: 61 ページ: 57～63
  • DOI: 10.1016/j.parkreldis.2018.11.028
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Neuropsychopharmacology of relaxin-3 (2019)
  • 著者名/発表者名: Toshihisa Ohtsuka
  • 学会等名: 第６回アジア神経精神薬理学会大会（AsCNP2019)
  • 国際学会
• [学会発表] シナプス分子間相互作用から捉える可塑性機構とその破綻 (2019)
  • 著者名/発表者名: 大塚稔久
  • 学会等名: 日本蛋白質科学会年会・日本細胞生物学会合同年次大会
  • 招待講演
• [備考] 山梨大学医学部生化学講座第一教室ホームページ
  • URL: http://www.med.yamanashi.ac.jp/basic/bioche01/