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本研究計画は、マウス原始卵胞の卵母細胞で形成されるP-body様の細胞質顆粒に着目し、その分子機能の理解に迫ると共に、卵胞成長活性化への関与について検証することを目的とした。同顆粒を可視化するため、DCP1AにGFPを融合したBACトランスジェニックマウスを用いて同顆粒を可視化することにした。
このマウスを用いて卵巣を透明化し、 撮影したZスタック画像の解析から、原始卵胞における同顆粒の体積は卵母細胞の体積と負の相関を示し、成長卵胞では顆粒は崩壊することが明らかとなった。続いて、卵母細胞特異的にDdx6をノックアウトしたところ、原始卵胞において同顆粒は崩壊し、異常な卵胞成長を開始して原始卵胞が早発に枯渇することが明らかとなった。これらの結果はDDX6依存的に形成されるP-body様の細胞質顆粒がRNA制御を介して原始卵胞の維持に働くことを示唆するものである。
続いて、同顆粒によって発現制御を受ける遺伝子群を同定するため、Ddx6ノックアウト卵母細胞を単離し、発現変動する遺伝子をRNA-seqにより網羅的に同定した。また、DDX6と結合するRNAを同定するため、3FLAGタグを融合した3FLAG-DDX6-GFPトランスジェニックマウスを作成し、RNA免疫沈降実験の準備を進めた。
一方、Ddx6変異体の解析からは同顆粒の形成意義について直接検証することが不可能である。この問題に取り組むためには、DDX6の分子機能を損なうことなく、顆粒形成のみを不全とする変異体の作成が必要である。そこで、DDX6の天然編成領域（IDR）に着目し、IDRに種々の変異を導入したDDX6-GFP発現ベクターをDdx6変異体に導入し、顆粒景性能を検証した。その結果、IDRの末端37アミノ酸がDDX6の顆粒形成に必要であることが明らかとなり、in vivoで顆粒形成の意義を解析する基盤を構築した。
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