| 研究実績の概要 |
遺伝子発現を制御するDNAメチル化の形成や維持機構の解明は、発生や分化の仕組みを知る上で重要である。DNAメチル化はゲノムのCG配列中のシトシンに起こる。分化した細胞の形質は分裂後も維持されていくが、その過程ではDNAメチル化の情報も塩基配列と同様に複製され継承される（DNA維持メチル化）。申請者はDNA維持メチル化の過程で、UHRF1がヒストンH3のK14, K18, K23をマルチモノユビキチン化し、これがDNAメチル化酵素DNMT1をメチル化DNAに呼び込むシグナルとして働くことを明らかにした。本申請では、UHRF1によるヒストンH3のマルチモノユビキチン修飾の形成機構をX線結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡による構造生物学的な手法によって解明することを目指した。
【in vitroユビキチン化実験】ユビキチン化のE1酵素、E2酵素、E3酵素（UHRF1）を用いて、in vitroでヒストンH3をユビキチン化する系を立ち上げた。基質にはFLAG-tagが付加したヒストンH3のN末端領域のペプチドを用いて、ユビキチン化H3を抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロッティンで検出した。
【ユビキチン化サイトの同定】In vitroユビキチン化反応で検出された1か所がモノユビキチン化されたヒストンH3のバンドを切り取って、ゲル内で酵素による断片化を行い、UHRF1によって最初にユビキチン化されるヒストンH3のリジン残基を同定した。
【UHRF1とE2酵素の複合体構造解析】
UHRF1のRINGドメインのE3酵素としての働きを構造生物学的な観点から明らかにするためにUHRF1のRINGドメインと活性化したユビキチンを付加したE2酵素の複合体の結晶化を行い、複合体と考えられる結晶の析出を確認した。
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