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本研究では進化分子工学による生体分子の改造・創成を実現する新規スクリーニング技術の開発を目的とする。具体的には1DNA 隔離、タンパク質発現・精製、機能評価、DNA 回収というスクリーニングプロセスをマイクロチャンバーデバイス内で実現する新規進化分子工学的スクリーニング技術を開発する。本研究が実現すれば、１デバイスあたり数万個～数十万個のライブラリの高精度スクリーニングが一日で可能になる。モデル生体分子としてはATPase を対象とし、ATPを分解して化学エネルギーを力学的エネルギーへと変換する分子機械F1-ATPase の改造や新規機能の創成への適応を目指す。スクリーニングを実現するにはATPase反応のデバイス内での検出が必要になる。そこで前年度に、ATP分解で生じるADP、Piを酵素カップリング反応により蛍光物質へと変換しデバイス内で検出する新規方法を開発し、10分子程度のATPaseの活性を蛍光で検出できることを示した。しかし、サンプルが存在しない場合でも偽陽性の信号が出る問題と、バックグラウンドの蛍光の上昇が大きいという問題が出てきた。そこで本年度は、この計測法の最適化を行った。具体的には、偽陽性信号の原因と考えられた酵素カップリング反応に用いる酵素を全て自前で調製・精製することにより、偽陽性信号の低減を試みた。また溶液の構成要素の検討を行うことで、バックグラウンドの蛍光上昇の低減を試みた。結果、偽陽性信号を1/33に、バックグラウンドの蛍光上昇を1/5に低減することに成功した。さらにこの最適化した実験系により、ATPase１分子のデバイス内検出を実現し、活性の低いATPaseと高いATPaseの活性を区別することにも成功した。これはこの新規検出系を用いることで、活性の高いATPaseをデバイス内でスクリーニング可能であることを示している。
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