発動分子の化学-力学エネルギー変換機構の解明に資する高速AFM技術の開発

2019 年度 実績報告書

• 研究領域: 発動分子科学：エネルギー変換が拓く自律的機能の設計
• 研究課題/領域番号: 19H05389
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 内橋 貴之 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30326300)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 高速原子間力顕微鏡 / 一分子計測 / タンパク質 / 構造変化

研究実績の概要

i) DNA修復酵素MRE11/RAD50/NBS1（MRN）の動態解析：ヒトのDNA修復を担うMRE11/RAD50/NBS1複合体（MRN）の構造を高速AFMで解析した。従来、Rad50ダイマーはフック部位が開いた開環構造を取と考えられてきたが、高速AFMにより、MRN複合体の多くは閉じたリング構造を形成し、また、定説とは逆側のヘッドと呼ばれる球状ドメインで開きアーム部の構造も異なることを明らかにした。ヒトのみならず酵母や大腸菌のMRNホモログの分子構造を解析し、新たに発見されたヘッド部位でのリング開閉運動が種を超えて保存されていることも明らかにした。さらに、酵母細胞中のMRNのフックをSMCタンパク質のヒンジドメインと入れ替えたキメラMRNを作製し、キメラMRが酵母のDNA損傷を修復可能であることを見いただした(Tatebe et al, Nat. Commun. 2020)。
ii) タンパク質分子針と脂質二重膜との相互作用解析(A01-3上野GおよびA01川野Gとの領域内共同研究)バクテリオファージ T4の細胞膜貫通部位から作製されあた人工分針の脂質二重層膜との動的相互作用を高速AFM観察し、分子針が脂質膜に貫入していく様子を観察することに成功した(Ueno, Nanoscale 2020)。
iii) ゲル微粒子のタンパク質取り込み過程の観察( B01鈴木Gとの領域内共研究)ハイドロゲル微粒子にタンパク質が取り込まれる過程を観察し、ゲル微粒子の構造と電荷状態に依存して取り込まれるタンパク質のサイズや機構が異なることを明らかにした(Matsui et al, Chem. Commun. 2019)。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究課題では、高速原子間力顕微鏡(AFM)による一分子動態計測を通し、発動分子の機能発現機構を明らかにする。また、高速AFM装置を基盤とした発動分子の化学-力学共役機構の解明に資する新規技術を開発することにある。高速AFMを用いた発動分子の機能動態解析は、研究実績の概要に記載しているように、DNA修復酵素や人工分針の機能動態、ハイドロゲル微粒子のタンパク質取り込み挙動などの観察に成功した。この他にも、ヘムタンパク質の集積過程(Hirayama et al, JACS, 2020 )や酵母プリオンのアミロイド構造 (Konnno et al, PNAS, 2020)のダイナミクス観察に成功して成果をあげつつある。領域内共研究も積極的に実施しており、現在8グループと共同研究を進めており、3グループとは既に共同研究の成果を論文として公表している。以上から、高速AFMを利用した発動分子のダイナミクス観察は順調に進捗している。
発動分子の化学-力学共役機構の解明に向けた新規技術に関しては、今年度はプラットフォームとなる探針走査型高速AFMの開発に注力した。設計・部品製作は終了し、現在組み立てと動作確認を行っているところである。現在までに、ガラス表面や脂質二重膜をテスト試料として高速AFM観察を行えるところまで確認できている。

今後の研究の推進方策

従来型の高速AFMを用いた発動分子の機能動態解析はこれまで同様に、領域家内共同研究を含めて積極的に実施していくことで、発動分子の創成に向けた領域の研究進展に尽力する。特に、最近A01上野Gと共同研究を開始した六量体リング状ATPaseのリング内協同性と化学-力学共役機構の解明を中心に行なう。装置開発に関しては、7月までに探針走査型高速AFMの立ち上げと操作性向上のためのソフトウェア開発を終える。次に、基板操作用のマニピュレータの製作に取り掛かる。弾性変形可能なPDMAを基板として、基板の力学操作が可能なことを確かめす。これに成功すれば、PDMS基板に微小管を固定し、微小管に伸長あるいは圧縮の力学負荷を印加しながら、キネシンの滑走状態を高分解能に観察し、レールタンパク質の構造変調とモータータンパク質の運動活性について研究する。また、PDMSとパターン基板を用いた中空脂質二重膜形成のためのパターン化井戸構造を持つ基板作製検討し、人工分子の脂質膜への再構成と膜内拡散のダイナミクス観察のための基盤技術を完成させる。

研究成果

• [雑誌論文] Dynamic behavior of an artificial protein needle contacting a membrane observed by high-speed atomic force microscopy (2020)
  • 著者名/発表者名: Takafumi Ueno, Kento Niwase, Daisho Tsubokawa, Kosuke Kikuchi, Natsumi Takai, Tadaomi Furuta, Ryuji Kawano, Takayuki Uchihashi
  • 雑誌名: Nanoscale 巻: 12 ページ: 8166-8173
  • DOI: 10.1039/D0NR01121E
  • 査読あり
• [雑誌論文] Construction of a Hexameric Hemoprotein Sheet and Direct Observation of Dynamic Processes of Its Formation (2020)
  • 著者名/発表者名: Koji Oohora, Shota Hirayama, Takayuki Uchihashi and Takashi Hayashi
  • 雑誌名: Chemistry Letters 巻: 49 ページ: 186-190
  • DOI: 10.1246/cl.190855
  • 査読あり
• [雑誌論文] On-Membrane Dynamic Interplay between Anti-GM1 IgG Antibodies and Complement Component C1q (2020)
  • 著者名/発表者名: Saeko Yanaka, Rina Yogo, Hiroki Watanab, Yuki Taniguchi,Tadashi Satoh, Naoko Komura, Hiromune Ando, Hirokazu Yagi, Nobuhiro Yuki, Takayuki Uchihashi, Koichi Kato
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 21 ページ: 147
  • DOI: 10.3390/ijms21010147
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Thermoresponsive Micellar Assembly Constructed from a Hexameric Hemoprotein Modified with Poly(N-isopropylacrylamide) toward an Artificial Light-Harvesting System (2020)
  • 著者名/発表者名: Shota Hirayama, Koji Oohora, Takayuki Uchihashi, Takashi Hayashi*
  • 雑誌名: Journal of American Chemical Society 巻: 142 ページ: 1822-1831
  • DOI: 10.1021/jacs.9b10080
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rad50 zinc hook functions as a constitutive dimerization module interchangeable with SMC hinge (2020)
  • 著者名/発表者名: Hisashi Tatebe, Chew Theng Lim, Hiroki Konno, Kazuhiro Shiozaki, Akira Shinohara, Takayuki Uchihashi and Asako Furukohri
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 370
  • DOI: 10.1038/s41467-019-14025-0
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Supramolecular tholos-like architecture constituted by archaeal proteins without functional annotation (2020)
  • 著者名/発表者名: Maho Yagi-Utsumi, Arunima Sikdar, Chihong Song, Jimin Park, Rintaro Inoue, Hiroki Watanabe, Raymond N. Burton-Smith, Toshiya Kozai, Tatsuya Suzuki, Atsuji Kodama, Kentaro Ishii, Hirokazu Yagi, Tadashi Satoh, Susumu Uchiyama, Takayuki Uchihashi, Koichi Kato
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 1540
  • DOI: 10.1038/s41598-020-58371-2
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Single-molecule imaging analysis reveals the mechanism of a high-catalytic-activity mutant of chitinase A from Serratia marcescens (2020)
  • 著者名/発表者名: Akasit Visootsat, Akihiko Nakamura Paul Vignon, Hiroki Watanabe, Takayuki Uchihashi and Ryota Iino
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 295 ページ: 1915-1925
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.012078
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hydrogel Microellipsoids that Form Robust String‐Like Assemblies at the Air / Water Interface (2019)
  • 著者名/発表者名: Kenshiro Honda, Yuka Sazuka, Kojiro Iizuka, Shusuke Matsui, Takayuki Uchihashi, Takuma Kureha, Mitsuhiro Shibayama, Takumi Watanabe, Daisuke Suzuki
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: 58 ページ: 7294-7298
  • DOI: 10.1002/anie.201901611
  • 査読あり
• [雑誌論文] Construction of a Quadrangular Tetramer and a Cage-Like Hexamer from Three-Helix Bundle-Linked Fusion Proteins (2019)
  • 著者名/発表者名: Takaaki Miyamoto, Yugo Hayashi, Keito Yoshida, Hiroki Watanabe, Takayuki Uchihashi, Kento Yonezawa, Nobutaka Shimizu, Hironari Kamikubo, Shun Hirota
  • 雑誌名: ACS Synthetic Biology 巻: 8 ページ: 1112-1120
  • DOI: 10.1021/acssynbio.9b00019
  • 査読あり
• [雑誌論文] Non‐Thermoresponsive Decanano‐sized Domains in Thermoresponsive Hydrogel Microspheres Revealed by Temperature‐Controlled High‐Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Yuichiro Nishizawa, Shusuke Matsui, Kenji Urayama, Takuma Kureha, Mitsuhiro Shibayama, Takayuki Uchihashi and Daisuke Suzuki
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: 58 ページ: 8809-8813
  • DOI: 10.1002/anie.201903483
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutational and Combinatorial Control of Self-Assembling and Disassembling of Human Proteasome α Subunits (2019)
  • 著者名/発表者名: Taichiro Sekiguchi, Tadashi Satoh, Eiji Kurimoto, Chihong Son, Toshiya Kozai, Hiroki Watanabe, Kentaro Ishii, Hirokazu Yagi, Saeko Yanaka Susumu Uchiyama, Takayuki Uchihashi, Kazuyoshi Murata, Koichi Kato
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 20 ページ: 2608
  • DOI: 0.3390/ijms20092308
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] High-speed AFM reveals accelerated binding of agitoxin-2 to a K+ channel by induced fit (2019)
  • 著者名/発表者名: Ayumi Sumino, Takashi Sumikama, Takayuki Uchihashi, Shigetoshi Oiki
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 5 ページ: eaax0495
  • DOI: 10.1126/sciadv.aax0495
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Dynamics of Inter-Molecular Interactions Between Single Aβ42 Oligomeric and Aggregate Species by High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Lei Feng, Hiroki Wantanabe, Paul Molino, Gordon Wallace, Son Lam Phung, Takayuki Uchihashi, Michael Higgins
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology 巻: 431 ページ: 2687-2699
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2019.04.044
  • 国際共著
• [雑誌論文] Protein Uptake into Individual Hydrogel Microspheres Visualized by High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Shusuke Matsui, Kensuke Hosho, Haruka Minato, Takayuki Uchihashi, Daisuke Suzuki
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 55 ページ: 10064-10067
  • DOI: 10.1039/C9CC05116C
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of heliorhodopsin (2019)
  • 著者名/発表者名: Wataru Shihoya, Takayuki Uchihashi, Hideki Kandori and Osamu Nureki (他21名)
  • 雑誌名: Nature 巻: 574 ページ: 132-136
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1604-6
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] The Fab portion of immunoglobulin G contributes to its binding to Fcγ receptor III (2019)
  • 著者名/発表者名: Rina Yogo, Yuki Yamaguchi, Hiroki Watanabe, Hirokazu Yagi, Tadashi Satoh, Mahito Nakanishi, Masayoshi Onitsuka, Takeshi Omasa, Mari Shimada, Takahiro Maruno, Tetsuo Torisu, Shio Watanabe, Daisuke Higo, Takayuki Uchihashi, Saeko Yanaka, Susumu Uchiyama and Koichi Kato
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 11957
  • DOI: 10.1038/s41598-019-48323-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Real-Time Visualization of Biological Molecules at Work with High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: IEEE International Conference on Manipulation, Manufacturing and Measurement on the Nanoscale 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] The 2nd NIBB-Princeton Joint Symposium on Imaging and Quantitative Biology (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi
  • 学会等名: Imaging of Single-Molecule Dynamics using High-Speed Atomic Force Microscopy
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Real-Time Monitoring of Morphological Change of Metal Surface During Corrosion Process with High-Speed Atomic Force Microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Takayuki Uchihashi, Mitsuhiro Okada, Miyuki Tanaka, Toshitaka Kubo, Tetsuo Shimizu
  • 学会等名: 27th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy (ICSPM27)
  • 国際学会
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡と生体・人工分子のダイナミクス計測 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 第23回コロイド・界面技術者フォーラム～コロイド領域のイメージング・評価技術～
  • 招待講演
• [学会発表] ダイナミンの動的分子イメージング：in vitro 再構成系×高速 AFM (2019)
  • 著者名/発表者名: 竹居孝二, 内橋貴之
  • 学会等名: ワークショップ「新しいコラボの在り方を探る～細胞生物学ｘ蛋白質科学」 第19回 日本蛋白質科学会年会, 第71回 日本細胞生物学会大会 合同年次大会
• [学会発表] 溶液中高速原子間力顕微鏡による生体・人工分子のダイナミクス解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: シンポジウム「原子間力顕微鏡技術のパラダイムシフト～原子から細胞まで階層をまたぐ構造・機能解析～」 日本顕微鏡学会 第75回学術講演会
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡による生細胞イメージング (2019)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 日本学術振興会 ナノプローブテクノロジー第167委員会 第91回研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡で可視化する分子ダイナミクス (2019)
  • 著者名/発表者名: 内橋貴之
  • 学会等名: 日本学術振興会 情報科学用有機材料第142委員会 合同研究会
  • 招待講演
• [図書] 自己修復材料、 自己組織化、形状記憶材料の開発と応用事例 (2020)
  • 著者名/発表者名: 内橋 貴之
  • 総ページ数: 446
  • 出版者: （株）技術情報協会
  • ISBN: 978-4-86104-781-7
• [備考] 名古屋大学D研ホームページ
  • URL: http://d.phys.nagoya-u.ac.jp/index.html