| 研究領域 | マルチモードオートファジー：多彩な経路と選択性が織り成す自己分解系の理解 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05342
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
谷田 以誠 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (30296868)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | オートファジー / 神経セロイドリポフスチン症 / カテプシン / in-resin CLEM / 光線－電子線相関顕微鏡法 |
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| 研究実績の概要 |
カテプシンDはリソソーム内主要タンパク質分解酵素であり、その遺伝子CTSD/ CLN10は神経セロイドリポフスチン症の原因遺伝子である。また神経セロイドリポフスチン症患者脳においてはαシヌクレインの蓄積が報告されており、神経セロイドリポフスチン症においてもプロテオイノパチーが神経変性に関与している可能性が考えられる。そこで、リソソーム機能不全をおこしているカテプシンD機能欠損モデルマウスの神経変性の発症を解析することにより、神経細胞特異的で神経変性に関わるモードのオートファジーが明らかにできるのではないかと考え、リソソーム機能低下から、神経変性に着目することで神経特異的に神経細胞維持に重要なモードのオートファジーを見出すことを目的としている。脳特異的CtsDノックアウトマウスについては、ファーストレポートを投稿準備中である。脳特異的CtsDノックアウトマウスについて、神経セロイドリポフスチン症に関わる表現型の他に、注目すべきタンパク質候補がいくつかピックアップされてきたので、それに関して、脳特異的CtsDノックアウトマウスの生化学的・免疫組織学的解析をおこなっている。また、加齢に伴う神経変性とCtsDノックアウトマウス脳の神経変性との関連性を見極めるために、老化マウス脳の試料をサンプリング中である。また培養細胞を用いて、カテプシンDの影響を見るために、CtsD KO セルラインを作成しつつある。また、神経におけるオートファジーをモニターするトランスジェニックマウスについて論文発表した。また、形態解析技術についてブレークスルー技術開発ができたので、それについても論文発表した。その後、これら研究については、プレスリリリースし、種々のネットニュースで取り上げられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
脳特異的CtsDノックアウトマウスの組織学的解析は、思ったより順調に進んでいる。CtsD KO Cell linesについても順調に進んでいる。ただコロナウイルスによる緊急事態宣言の影響でマウスの飼育を縮小せざるを得なく、脳特異的CtsDノックアウトマウスの繁殖が遅延してしまい、プロテオミクス解析目的の個体数の維持確保に支障が出た。その後、今年になってようやく個体数が増えてきたため、プロテオミクス解析を推進する。プロテオミクス解析からは未知の因子をスクリーニングするのが主目的であるが、先行する免疫組織学的スクリーニングから、いくつかの候補因子が見いだされてきたので、そちらの方を優先的に遂行していく。
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| 今後の研究の推進方策 |
神経特異的モードのオートファジーに関わる因子についての培養細胞レベルでの検討のために、CtsDノックアウトマウス脳で有意に増加しているタンパク質について、実際の神経変性に関わっているかを検討するため、培養細胞を用いて、細胞の生存率や神経細胞分化能を指標として評価する。神経芽細胞腫由来のSH-SY5YやNeuro2aをもとにノックアウト細胞を作成し神経細胞に分化誘導し、評価する予定である。可能であれば、これら細胞株でうまく評価ができそうに無いときは、CtsDノックアウトマウス脳より、初代神経培養細胞を単離して評価する事を検討する。またタモキシフェン誘導型脳神経細胞Creリコンビナーゼを活性化できるトランスジェニックマウスが利用できるかもしれないので、その点を検討する。
CtsDノックアウトマウス脳で有意に増加している候補タンパク質について、初代神経培養細胞、SH-SY5YやNeuro2aを用いて、神経細胞毒性があるか否かを検討し、神経細胞に対する毒性が上昇するか、あるいは、タンパク質間相互作用があるかどうかの検討をおこなう。
神経特異的モードのオートファジーに関わる因子についてのCtsDノックアウトマウスを用いた個体レベルでの評価については、週齢に分けて、脳試料を準備中であり、これをもちいて免疫組織学的に神経変性・細胞死を評価する。また組織のおけるin-resin CLEM法の確立を目指し、in-resin CLEMを用いて、蛍光像と電子顕微鏡像を相関させることにより、神経細胞、ミクログリア、アストロサイトなどの形態学的相関を明らかにしオートファジーに関わる形態異常を調べる。
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