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2021 年度 実績報告書

インスリン分泌顆粒分解の空間的・時間的評価と分子機構および病態生理学的意義の検討

公募研究

研究領域マルチモードオートファジー:多彩な経路と選択性が織り成す自己分解系の理解
研究課題/領域番号 20H05343
研究機関順天堂大学

研究代表者

西田 友哉  順天堂大学, 医学部, 准教授 (10581449)

研究期間 (年度) 2020-04-01 – 2022-03-31
キーワードオートファジー / インスリン分泌顆粒 / 膵β細胞 / 糖尿病 / ゲノムワイドスクリーニング
研究実績の概要

今年度の研究においては、(1)インスリン分泌顆粒分解の適切な誘導条件の検討(2)インスリン分泌顆粒分解レポーターの作成、および(3)CRISPR/Cas9システムによる高効率ゲノム編集Cas9発現膵β細胞株のクローニングを実施した。最終的にインスリン分泌顆粒分解制御因子をゲノムワイドスクリーニングによって同定することを目標とした。
はじめに、クローニングにより樹立したCas9発現MIN6細胞を使用し、既知のマクロオートファジー遺伝子がインスリン分泌顆粒分解にどのように関与しているかについて検討を行った。Atg遺伝子の機能グループに応じて、(1)Ulk1複合体(2)PI3K複合体(3)Atg9複合体(4)Atg5-12複合体に関して、構成分子のノックアウト細胞を作成した。それらをグルコース飢餓刺激後、ウェスタンブロットによるプロインスリン・クロモグラニンAの定量、さらにインスリン分泌顆粒分解レポーターによるインスリン分泌顆粒分解の定量により評価した。
その結果、いずれの複合体の構成因子のノックアウトによってもインスリン分泌顆粒分解は阻害されず、マクロオートファジーの制御機構のインスリン分泌顆粒分解への関与は乏しいものと考えられた。
次に、Cas9およびインスリン分泌顆粒分解レポーターを発現したMIN6細胞にゲノムワイドgRNAを導入して飢餓刺激を行い、EGFPの減弱が阻害される、すなわち分泌顆粒分解が阻害されていると考えられる細胞群をフローサイトメトリーにて濃縮し、次世代シークエンスによって解析した。
現在、それらの結果に基づき、インスリン分泌顆粒分解の制御因子の同定を行っている。候補となる遺伝子のノックアウトMIN6細胞を作成してその妥当性を確認し、機能解析に進むことを計画している。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2021

すべて 雑誌論文 (1件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Defective autophagy in vascular smooth muscle cells enhances the healing of abdominal aortic aneurysm2021

    • 著者名/発表者名
      Mochida Akihiro、Mita Tomoya、Azuma Kosuke、Osonoi Yusuke、Masuyama Atsushi、Nakajima Kenichi、Goto Hiromasa、Nishida Yuya、Miyatsuka Takeshi、Mitsumata Masako、Watada Hirotaka
    • 雑誌名

      Physiological Reports

      巻: 9 ページ: e15000

    • DOI

      10.14814/phy2.15000

  • [学会発表] 蛍光レポーターによるインスリン分泌顆粒分解評価の確立とその分子機構の解明2021

    • 著者名/発表者名
      西田友哉
    • 学会等名
      第14回オートファジー研究会

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公開日: 2022-12-28  

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