| 研究領域 | マルチモードオートファジー：多彩な経路と選択性が織り成す自己分解系の理解 |
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| 研究課題/領域番号 |
20H05352
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
中村 咲耶 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 訪問研究員 (20845151)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | クロロファジー / 葉緑体 / ミクロオートファジー / 光障害 / シロイヌナズナ |
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| 研究実績の概要 |
本計画では、損傷葉緑体を除去する選択的ミクロオートファジー「ミクロクロロファジー」作動の仕組みを解明し、マルチモードオートファジーの一経路として確立することを目指す。特に、ミクロクロロファジーの作動機構として、生体膜ダイナミクスと、関連遺伝子の機能、の2点に焦点を当てた解析を行い、令和２年度は以下のような進展があった。
(1) 生体膜ダイナミクスのイメージング：オートファゴソームマーカーであるATG8と液胞膜の二重蛍光発現株の作出、整備に成功した。この系統を用いたタイムラプスイメージングを行い、損傷葉緑体上でATG8を含む構造体が伸長し、液胞膜と接している様子が観察された。
(2) コアATG遺伝子群の必須性調査：これまでに報告されているシロイヌナズナのコアATG遺伝子の欠損株について、オートファジー活性を評価するための各種蛍光タンパク質マーカー発現株を整備した。そして葉緑体オートファジーである部分分解経路とクロロファジーの活性評価を随時進めた。その結果、マクロオートファジーには必須とされるコアATG遺伝子のうち、ミクロクロロファジーの活性には重要ではないものがあることを見出した。さらに、これまでにシロイヌナズナで報告のないATG遺伝子欠損株について、ストックセンターより取り寄せたのち、遺伝子発現量解析によりATG遺伝子が欠損していることを確認した。
(3) クロロファジー機能関連遺伝子の機能解析：クロロファジー機能関連遺伝子の原因遺伝子候補である膜交通関連因子について、液胞膜およびATG8可視化系統をそれぞれ作出した。さらに、局在解析を行うため、各種単膜系オルガネラ (ゴルジ体、トランスゴルジネットワーク、Multi vesicular body) と候補遺伝子を蛍光タンパクで可視化した系統を作出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
上記の項目 (1) については、ATG8と液胞膜の同時可視化に成功しており、今後さらにタイムラプスイメージング解析をかさねることで、損傷葉緑体を液胞膜で取り込む際の詳細な観察を行うことが出来る。項目 (2) については、既に整備されているコアATG欠損株について、プロセシング解析に供する蛍光タンパク質発現コンストラクトを導入した。報告の無いATG欠損株についても、欠損を確認した株で同様に遺伝子組換え植物を作出した。項目 (3) では、原因遺伝子の可視化および各種単膜系オルガネラとの局在解析用の植物を作出した。よって、本研究計画はおおむね順調に進行していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本計画はおおむね順調に進展しており、大きな計画変更は行わずに進めていく。未知の遺伝子機能を評価する必要がある項目3の推進においては、得られた結果を慎重に考察しながら必要な解析を随時検討していながら進める。
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