高速分子動画でみる金属酵素活性中心におけるNO還元反応

2021 年度 実績報告書

• 研究領域: 高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
• 研究課題/領域番号: 20H05451
• 研究機関: 国立研究開発法人理化学研究所
• 研究代表者: 當舎 武彦 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (00548993)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 金属酵素 / 一酸化窒素 / X線自由電子レーザー / 時間分解計測 / 反応中間体 / ヘム / 嫌気条件 / X線結晶構造解析

研究実績の概要

ヘム鉄および非ヘム鉄からなる膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）の複核活性中心で行われる一酸化窒素（NO）還元の反応機構の解明のために、X線自由電子レーザーを利用した時間分解X線結晶構造解析によりNORの反応途中の構造を明らかにすることを目的としている。これまでの研究から、紫外光照射によりNOを発生するケージドNOを反応開始のトリガーとした時間分解計測が可能であることを示してきており、本課題では、NORの結晶試料にケージドNOを浸潤させた試料を用い、時間分解構造解析を行うことを計画している。NORによるNO還元反応は、還元型NORにNOが結合することで進行するため、還元型NORの酸素分子による自動酸化を防ぐことが重要となる。つまり、NORの反応を時間分解構造解析により追跡するためには、嫌気条件下での時間分解X線構造解析を行う必要がある。そこで、本課題では、酸素分子を透過させない酸素バリア性フィルムを用いてNORの結晶試料を包み込んでＸ線回折実験を行うことを考えた。
昨年度の実験からエチレン・ビニルアルコール共重合体からなる酸素バリア性フィルムを用いることでNORの還元状態を保持することができることを見出したので、引き続き同フィルムを用いて実験を行った。酸素バリア性フィルムを用い、サンドイッチ法により脂質キュービック相（LCP）法で結晶化を行い、酸化型NORの結晶を得た。得られた結晶をフィルム事くり抜き専用のホルダに貼り付けることで、フィルムを開封することなくX線回折実験を行った。フィルムによる強い散乱が生じるものの、結晶化条件の最適化の結果、2.4 Åの分解能で構造解析を行うことができた。また、ケージドNO存在下でも良質な結晶を得ることがきており、今後の時間分解計測にむけての準備が整ったと言える。

現在までの達成度 (段落)

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] リバプール大学/Diamond Light Source/エセックス大学(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: リバプール大学/Diamond Light Source/エセックス大学
  • 他の機関数: 2
• [雑誌論文] Mechanism of substrate inhibition in cytochrome-c dependent NO reductases from denitrifying bacteria (cNORs) (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsumura Hirotoshi、Faponle Abayomi S.、Hagedoorn Peter-Leon、Tosha Takehiko、de Visser Sam P.、Moenne-Loccoz Pierre
  • 雑誌名: Journal of Inorganic Biochemistry 巻: 231 ページ: 111781～111781
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2022.111781
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • 著者名/発表者名: Kwon H., Basran J., Pathak C., Hussain M., Freeman S. L., Fielding A. J., Bailey A. J., Stefanou N., Sparkes H. A., Tosha T., Yamashita K., Hirata K., Murakami H., Ueno G., Ago H., Tono K., Yamamoto M., Sawai H., Shiro Y., Sugimoto H., Raven E. L., Moody P. C. E.
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: 60 ページ: 14578～14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography (2021)
  • 著者名/発表者名: Nomura T., Kimura T., Kanematsu Y., Yamada D., Yamashita K., Hirata K., Ueno G., Murakami H., Hisano T., Yamagiwa R., Takeda H., Gopalasingam C., Kousaka R., Yanagisawa S., Shoji O., Kumasaka T., Yamamoto M., Takano Y., Sugimoto H., Tosha T., Kubo M., Shiro Y.
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118 ページ: -
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Heme controls the structural rearrangement of its sensor protein mediating the hemolytic bacterial survival (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01987-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Time-resolved techniques provide mechanism for nitric oxide reduction by nitric oxide reductase (2021)
  • 著者名/発表者名: Tosha T., Takeda H., Shiro Y., Kubo M.
  • 学会等名: Pacifichem 2021
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を利用した一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第94回日本生化学大会
  • 招待講演
• [図書] 第4章、第2節 生体鉄の分子科学と細胞生物学、“生命金属ダイナミクス 生体内における金属の挙動と制御” (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣、澤井仁美、當舎武彦
  • 総ページ数: 13
  • 出版者: NTS出版