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本研究は細胞内輸送に関わる分子モータータンパク質が、複数集まって輸送を行う際の分子モーター間の協調性の仕組みを明らかにすることを目的とする。そのために本年度は、昨年度作成したキネシンの単頭を双頭キネシンに直接連結させた変異体キネシンを用い、単頭を運動能のない変異体キネシンに置きかえて微小管上に固定することにより、双頭キネシンに負荷をかけてそのときの内部構造状態を一分子FRET法によって観察した。キネシン2量体の尾部に微小管に結合した後解離することのできない変異体キネシン頭部を融合したキネシンを作成し、その運動を蛍光一分子イメージング法を用いて観察したところ、一部のキネシンは野生型と同じ速度で運動したものの、大部分のキネシンは見かけ上停止して微小管上に固定された。次にこのコンストラクトの野生型頭部に二つの頭部間の位置関係を区別することのできるFRETプローブを導入し、一分子FRET法を用いて負荷存在下でのキネシンの構造変化の検出を行った。飽和ATP濃度条件下で運動中の個々のキネシン分子のFRET効率変化を観察したところ、短い間両足結合状態を取るが、主に片足結合状態を取ることが示された。この結果は無負荷状態で運動中のキネシンの場合(主に両足結合状態を取る)と大きく異なるものであり、ATP結合に伴う片足結合状態から両足結合状態への遷移が運動サイクル中に強い負荷依存性を持つことを示すものである。これらの結果は、複数のキネシンが協調して運動する際の分子間に働く負荷の役割を説明するものである。
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