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(1) FRETによる膜結合型AAA+プロテアーゼの基質分解リアルタイム測定
FRET法を用いてFtsHの基質とりこみ(分解)速度をリアルタイムで観測する系を構築し、FtsHによる基質のとりこみや分解による蛍光強度の変化を蛍光分光器で観測する。この系を使って、ATP加水分解活性と分解速度の相関関係や種々の変異体解析によるFtsHの基質とりこみに必須な領域、基質特異性を検討することでFtsHの詳細な基質とりこみの分子メカニズムを明らかにする。21年度はこれらの系を構築するためのFtsH変異体及び基質の作製を行った。
(2)-分子FRET観察による膜結合型AAA+プロテアーゼの基質機構の測定
FtsHは「基質結合」、「基質とりこみ」、「基質分解」の反応ステップを繰り返して機能すると考えられる。上述のFRET実験系を、蛍光顕微鏡を用いて-分子レベルで観測する。その画像データを統計処理して速度論的パラメータを算出し、各反応ステップを明らかに。21年度はこれらの実験系を構築するためのFtsH変異体及び基質の作製を行った。特に-分子観測条件では解離するFtsHを、ジスルフィド結合を用いて六量体を安定化する変異体を作製した。
(3)FCCSによる膜結合型AAA+プロテアーゼの基質相互作用、分解の測定
蛍光相互相関法を用いて分解中のFtsHと基質の状態を観察し、FtsHの分解様式を検証する。21年度はこれらの系を構築するためのFtsH変異体及び基質の作製を行った。
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