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本年度は細胞純化後にマイクロアレイにより同定した未分化型精原細胞と分化型精原細胞特異的遺伝子サブセット候補の、精巣内での実際の発現を定量的PCR、免疫組織化学、さらにFACSを用いて検討を行った。その結果、各サブセット特異的と考えられる遺伝子群を同定することができた。とりわけ、表面抗原遺伝子ではFACSで未分化型精原細胞が単離できることが示唆された。現在、これらの遺伝子サブセットの上流プロモーターを解析して、未分化型精原細胞の遺伝子特性を規定する転写因子の検索と精巣での発現の確認を進めている。一方、これまで報告した未分化型精原細胞サブセット純化法には非生殖細胞がまだ混入しており、これらが各サブセットの遺伝子発現プロファイルを撹乱していることも確認できた。そこで、これら非生殖細胞を除去するために、非生殖細胞をMACSとFACSを組み合わせて除去する方法の検討を進めている。主に表面抗原で非生殖細胞の除去を試みたが、E-cadherinなど、未分化精原細胞に比較的発現が高いとされる表面抗原も実際は非生殖細胞にも発現しており、表面抗原からのアプローチは困難であることが明らかとなった。そこで現在、生殖細胞、あるいは非生殖細胞特異的遺伝子プロモーター下で蛍光蛋白を発現するマウスラインを用いてさらなる未分化型精原細胞の純化を試みている。この方法を確立することで、本課題の目標である精原細胞サブセットを包括的に制御する因子のより鋭敏な同定が可能になると考えられる。
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