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遺伝情報発現は転写調節によってその大半が制御されている。特に真核生物において、その転写調節は転写因子のDNAへの結合がトリガーとなる。従って、転写因子-DNA間の相互作用の定量的解明はとも言える。しかしながら、これまで転写因子の機能解析に用いられてきた手法では細胞内での時空間的解析が困難であった。そこで、本申請では蛍光相互相関分光法(Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy : FCCS)を用い、転写因子-DNA相互作用とそれに伴う転写活性化量を経時的かつ定量的に測定可能な系の確立を目的とした。
今年度は、溶液での測定系構築を目指し、EGFP融合核内転写因子(グルココルチコイド受容体)の単離・精製を行い、FCCSによる蛍光ラベル化されたDNAとの相互作用検出のためのBuffer等の最適化を行った。また、転写活性化量を蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy : FCS)で定量するために用いる蛍光タンパク質融合RNA特異的結合タンパク質(MS2 Coat Protein)の構築を行った。
さらに、この「転写因子のDNA結合・転写活性同時評価法」を生細胞内で測定可能にするために、細胞内へのマイクロインジェクション装置の整備を行った。
このように、転写に関わる遺伝情報場の解明にむけて、溶液中での測定だけなく、生細胞への応用も見据えた測定系の基盤が整えることができた。次年度は溶液中における転写因子のDNA結合・転写活性同時評価法を完成させるとともに、生細胞への応用を本格的に行う予定である。
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