| 研究実績の概要 |
本研究では、炎症、細胞死、選択的オートファジーや免疫制御に重要な直鎖型ユビキチン鎖を誘導する、ユビキチンリガーゼ複合体LUBACに着眼した。LUBACを構成する分子の細胞内動態、組織や細胞腫特異的なシグナルネットワークの形成とその生物学的効果を解明するのに適した分子ツールの開発することによるLUBAC の新規制御メカニズムの解明を目指して、申請者のチームが取得した単量体、単一ドメインの小分子であるナノボディーを利用した。期間中に、各LUBAC 構成因子を抗原とするラマ由来ナノボディークローンの精製法、ナノボディークローンのユビキチン化に対する影響の解析法、および細胞内における発現誘導法、ナノボディークローンによる免疫沈降法の各手法について確立した。ナノボディーのクローンは、anti-HOIP, anti-SHARPIN, anti-HOIL-1の全てにおいて、e.coliから効率的にリコンビナントタンパク質を得ることができた。特にanti-HOIL-1ナノボディークローンについては、in vitro ユビキチン化再構築系の実験により、LUBAC依存性のユビキチン化誘導を促進、もしくは抑制するクローンを得た。さらに、各クローンが免疫ブロッティング、免疫沈降において機能するかについても解析を行った。これらの解析結果を基に3クローンを選択し、抗原タンパク質との結合能、エピトープの解析を行った。さらに、細胞内においてGFP-tagナノボディーを発現し、細胞死に対する影響も解析した。本研究成果を基盤として、今後もanti-HOIP, anti-SHARPINの残りのクローン解析、細胞内動態と新規結合分子の解析について解析を進めていく。これらの研究成果および関連する概念について、当該年度中に国内および国際学会、国際雑誌に総説（査読あり）として発表している。
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