臨界期の母体ストレスが惹起する新奇のGABA-アセチルコリン神経回路

2021 年度 実績報告書

• 研究領域: 脳の若返りによる生涯可塑性誘導ーｉＰｌａｓｔｉｃｉｔｙー臨界期機構の解明と操作
• 研究課題/領域番号: 21H05687
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
• 研究期間 (年度): 2021-09-10 – 2023-03-31
• キーワード: GABA / アセチルコリン / 細胞発生 / Gad1 / 胎生ストレス

研究実績の概要

１．臨界期ストレス胎仔脳の遺伝子発現解析：妊娠15 日の母体に拘束ストレスを3 日間加え、胎生18日および生後3週でGad1+/GFPヘテロ胎仔（Two-hit）脳のACh細胞に関連するLhx8, Isl1, Ngfr, ChAT, Lhx6, Slc18a3 mRNAの発現量を定量的にRT-PCRで同腹野生型と比較した。胎生18日Two-hitですべての発現が増加傾向にあったが有意差はつかず、生後3週ではすべて有意に増加した。
２．臨界期ストレス暴露大脳皮質錐体細胞の電気生理学的解析：生後3-8 週齢で、大脳皮質内側前頭前野（mPFC）スライス標本の錐体細胞からパッチクランプでトニックGABA抑制電流、自発性（sIPSC）、刺激誘発性（eIPSC）及び微小抑制性シナプス後電流（mIPSC）を記録した。抗コリンエステラーゼ（ドネペジル）は対照群(Gad1+/GFPヘテロ 無ストレス)でsIPSC の頻度と振幅を増加したがTwo-hitに無効であった。一方、ムスカリン性ACh受容体阻害薬（アトロピン）を加えると対照群とTwo-hitの差はなくなった。以上から、Two-hit ではACh入力が増しGABA作動性抑制性神経伝達が強化され、少なくとも一部はムスカリン性受容体の関与が示唆された。
３．臨界期ストレス暴露成体脳の免疫組織化学的解析：妊娠15 日の母体に細胞発生マーカーEdU を腹腔注射し、拘束ストレスを加えた。抗ChAT抗体、抗EdU抗体の2重染色で線条体や前脳基底部でのACh細胞の発生数を解析したが、同腹野生型と有意差はなかった。１．の結果と合わせACh細胞の分化が亢進し、mPFCへのAChの軸索投射が増加したと考えられた。
４．臨界期ストレス暴露成体大脳皮質GABA 細胞の電気生理学的機能解析：生後3-8 週齢でmPFC のスライス標本のGABA 細胞（GFPで同定）からパッチクランプ記録を行った。自発性興奮性シナプス後電流（sEPSC）に変化はなかった。一方で、電流‐発火関係解析では膜特性変化による興奮性上昇が明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

GABA細胞からACh細胞への発生の転化（GABA細胞減少とACh細胞の増加）ではなく、ACh細胞の分化にシフトした結果、mPFCへのAChの軸索投射が増加したことを明らかにできたこと。さらに、錐体細胞でのGABAシナプス電流の強化は、GABA細胞へのグルタミン酸作動性興奮性入力が増えたことではなく、ACh入力が増加したことで、GABA細胞の興奮性が増したことが原因である可能性を示したことによる。

今後の研究の推進方策

１．臨界期ストレス暴露大脳皮質錐体細胞の電気生理学的解析：昨年度に引き続き以下を行う。生後3-8 週齢で、大脳皮質内側前頭前野（mPFC）スライス標本を作製し錐体細胞からパッチクランプ記録を行う。抗コリンエステラーゼ（ドネペジル）、選択的ACh受容体阻害薬：アトロピン（ムスカリン性）、methyllycaconitine（MLA；ニコチン性α7）、dihydro-β-erythroidine（DhβE；ニコチン性α4β2）を投与し、抑制性電流の変化を対照群(Gad1+/GFPヘテロ 無ストレス)と比較する。強化されたGABA作動性抑制性神経伝達がAChによっておこることを証明し、関与する受容体サブタイプを同定する。
２．臨界期ストレス暴露成体大脳皮質GABA 細胞の電気生理学的機能解析：昨年度に引き続き以下を行う。生後3-8 週齢でmPFC のスライス標本を作製してGABA 細胞をGFP（knock-in）で同定し、パッチクランプ記録を行う。昨年度の結果で、膜興奮性の上昇として発火閾値の低下と発火頻度の上昇がみられたので、変化した電流を同定する。さらにドネペジルやACh受容体阻害薬の作用を確認して、AChによるGABA細胞の形質変化を証明する。
３．臨界期ストレス暴露成体大脳皮質の神経回路機能解析：大脳皮質カラム構造の形成に発達過程におけるACh作動性の皮質入力が関与する（Dupont, Nature 2006）。そこで、生後3-8 週齢でmPFC のスライス標本を作製し、膜電位光学測定法によるイメージングで白質の電気刺激で誘発された興奮伝播（特に側方拡散）を対照群と比較して、モデルにおける機能的カラム構成と神経回路機能の変化を解析する。コリンエステラーゼ及び抗コリンエステラーゼ、選択的ACh受容体阻害薬：アトロピン、MLA、DhβEを投与して興奮伝播観察による神経回路機能評価を行い、臨界期ストレス暴露によるACh入力の増加とその影響を明らかにする。あるいはin vivo 2光子によるCaイメージング法で、 ACh入力の影響を明らかにする。

研究成果

• [国際共同研究] Yale School of Medicine(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Yale School of Medicine
• [国際共同研究] マインツ大学(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: マインツ大学
• [雑誌論文] Elucidation of pathological mechanism caused by human disease mutation in CaMKIIβ (2022)
  • 著者名/発表者名: Mutoh H, Aoto K, Miyazaki T, Fukuda A, Saitsu H.
  • 雑誌名: Journal of Neuroscience Research 巻: 100 ページ: 880-896
  • DOI: 10.1002/jnr.25013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Orchestration of Ion Channels and Transporters in Neocortical Development and Neurological Disorders (2022)
  • 著者名/発表者名: Bando Y, Ishibashi M, Yamagishi S, Fukuda A, Sato K.
  • 雑誌名: Frontiers in Neuroscience 巻: 16 ページ: 827284
  • DOI: 10.3389/fnins.2022.827284
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] GABAA receptors and maternally derived taurine regulate the temporal specification of progenitors of excitatory glutamatergic neurons in the mouse developing cortex. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tochitani S, Furukawa T, Bando R, Kondo S, Ito T, Matsushima Y, Kojima T, Matsuzaki H, Fukuda A.
  • 雑誌名: Cerebral Cortex 巻: 31 ページ: 4554-4575
  • DOI: 10.1093/cercor/bhab106
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional MHCI deficiency induces ADHD-like symptoms with increased dopamine D1 receptor expression (2021)
  • 著者名/発表者名: Meng Hong-Rui, Suenaga T, Edamura M, Fukuda A, Ishida Y, Nakahara D, Murakami G.
  • 雑誌名: Brain, Behavior, and Immunity 巻: 97 ページ: 22-31
  • DOI: 10.1016/j.bbi.2021.05.015
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] ATP6V0A1 encoding the a1-subunit of the V0 domain of vacuolar H+-ATPases is essential for brain development in humans and mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Aoto K, Kato M, Akita T, Nakashima M, Mutoh H, Akasaka N, Tohyama J, Nomura Y, Hoshino K, Ago Y, Tanaka R, Epstein O, Ben-Haim R, Heyman E, Miyazaki T, Belal H, Takabayashi S, Ohba C, Takata A, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 12 ページ: 2107
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22389-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Cl-ホメオダイナミクスとマルチモーダル GABA:中部生理学会からの展開. (2022)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫
  • 学会等名: 第99回日本生理学会大会
• [学会発表] Orexin receptor activation induces a novel slow afterhyperpolarization in serotonergic dorsal raphe neurons. (2022)
  • 著者名/発表者名: Ishibashi M, Fukuda A, Leonard CS.
  • 学会等名: 第99回日本生理学会大会
• [学会発表] Regulated KCC2 phosphorylation is critical for dynamic GABA-mediated inhibition. (2022)
  • 著者名/発表者名: Watanabe M, Kahle KT. Fukuda A.
  • 学会等名: 第99回日本生理学会大会
• [学会発表] 胎生期ストレスとGad1ヘテロ欠損の二重ヒットによるDNAメチル化により惹起された神経細胞分化と回路の運命転化. (2022)
  • 著者名/発表者名: 王天英, Adya Saran Sinha, 柳川右千夫, 河合智子, 秦健一郎, 福田敦夫.
  • 学会等名: 第30回日本病態生理学会大会
• [学会発表] 母体ストレスとGad1異常が惹起するGABA-アセチルコリン神経回路. (2022)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫
  • 学会等名: 学術変革領域研究(A)（臨界期生物学）2021年度領域班会議
• [学会発表] Caloric restriction mediated hypothalamic-pituitary-adrenal axis regulation is dependent on a subset of AgRP neuronal activation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Yesmin R, Watanabe M, Sinha AS, Ishibashi M, Akita T, Fukuda A.
  • 学会等名: 第48回日本脳科学会
• [学会発表] オレキシンは縫線核セロトニン作動性ニューロンにおいて非選択的陽イオンチャネルの閉口による発火後過分極を誘発する. (2021)
  • 著者名/発表者名: 石橋賢，福田敦夫，Leonard S Christopher.
  • 学会等名: 第68回中部日本生理学会
• [学会発表] 発達性てんかん性脳症を引き起こすKv2.1 R306C 変異の大脳皮質錐体神経発火活動への影響について. (2021)
  • 著者名/発表者名: 秋田天平，青戸一司，才津浩智，福田敦夫.
  • 学会等名: 第68回中部日本生理学会
• [学会発表] リン酸化によるカリウム-クロライド共輸送体(KCC2)の機能制御. (2021)
  • 著者名/発表者名: 渡部美穂, Kahle KT, 福田敦夫.
  • 学会等名: 第68回中部日本生理学会
• [学会発表] 母体ストレスが胎児に与える影響：動物モデルからの警鐘. (2021)
  • 著者名/発表者名: 福田敦夫
  • 学会等名: 第9回新胎児学研究会
• [備考] 浜松医科大学医学部神経生理学講座ホームページ
  • URL: https://www.hama-med.ac.jp/education/fac-med/dept/neurophysiology/index.html
• [備考] 浜松医大プレスリリース（Nature Communicationsへ研究成果公表）
  • URL: https://www.hama-med.ac.jp/topics/2021/26884.html
• [備考] 浜松医大プレスリリース（Cerebral Cortexへ研究成果公表）
  • URL: https://www.hama-med.ac.jp/topics/2021/26955.html
• [備考] 浜松医大プレスリリース（Brain, Behavior, and Immunityへ研究成果公表）
  • URL: https://www.hama-med.ac.jp/topics/2021/27089.html
• [備考] みらいぶっく 学問・大学なび【最先端研究を訪ねて】
  • URL: https://www.sekaiwokaeyo.com/ni153/