| 研究概要 |
固定子aサブユニットにSNAPタグ、回転子εサブユニットにCLIPタグを導入したF_oF_1に
Alexa647-benzylguanineおよびTMR-benzylcytosineを反応させ特異的結合を確認した。またリポソームに再構成した蛍光標識FoF1の1分子FRET計測を行い、回転子の向きを反映した3段階(L,M,H)のFRET効率が得られた。しかしながらFRETの経時変化計測では、一方向の回転に対応するL→M→H→Lといった順序だったFRET変化をみせた分子の割合は約20%と低く、L→M→Lのように2状態を可逆的に遷移する分子が多くみられた。この原因として、1)タグの位置が適切でなく蛍光色素の位置が一意に決まらない、2)リポソーム膜にきちんと再構成されていないFoF1の割合が高い、等の可能性が考えられた。1)の可能性を検証するため、タグの位置を変えたFoF1を様々に作製し改善を試みた。しかしながら現在までのところ大幅な改善には至っていない(1)。よって2)の可能性が高いと考えられた。
一方、大腸菌ではFoF1の細胞膜への再構成の効率は問題にする必要はない。そこで大腸菌での1分子計測を行うため、蛍光色素で標識後に菌体を培養し蛍光標識FoF1の密度を低下させた。その結果、細胞膜上を拡散する1分子FoF1の観察に成功した。しかしながら、Alexa647-benzylguanineの細胞膜透過性が低く、大腸菌内での1分子FRET計測には至らなかった。
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