| 研究概要 |
本年度は細胞周期依存的にリン酸化制御を受けることが細胞分裂に必須な、細胞骨格タンパク質ビメンチンSer71,Ser82について、そのリン酸化修飾を蛍光強度でリアルタイムに検出する方法を開発し、改良を行った。
最近我々のグループにより、N末端近傍を無細胞蛋白質合成系を用いて蛍光色素TAMRAでピンポイント標識した一本鎖抗体scFvあるいはFabを用いて、抗原非存在下における抗体内部の芳香族残基による消光(クエンチ)が抗原の結合によって顕著に解消される現象が見出された。この現象を応用することで、現在までに抗原結合によって蛍光強度が増加する、多数の抗体プローブ(Quenchbody)が作製されている。この抗体プローブ法でビメンチン内Ser71のリン酸化を認識する抗体TM71をプローブ化したところ、抗原非存在時,非リン酸化ペプチド存在時と比較してリン酸化Ser71ペプチド抗原存在時にのみ、有意な蛍光強度の上昇が見られた。また、プローブの抗原結合部位近傍に蛍光を消光しやすい残基を導入することで、抗原依存的な蛍光強度上昇を向上させることに成功した。現在,測定条件の検討と更なる変異導入により,信号変化率の向上を図っている。
また、今後の細胞内導入を念頭に,より大量のプローブ調製のためペプチド認識モデル抗体scFvのN末端近傍にラベルのためのCys残基を付加して大腸菌で発現させた。これを精製した後,SH基を介して蛍光ラベルを導入したscFvを調製することに成功し,試験管内で十分な抗原認識能を有することも確認した。現在,蛍光測定と生細胞への導入条件を検討している。また,特に細胞内でscFvより安定と考えられる蛍光標識Fab断片の調製を進めている。
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