公募研究
我々は抗原受容体遺伝子再構成に関して研究を行ない、転写因子E2Aが組換え部位に直接結合し、ヒストンアセチル化を上昇させ組換えを誘導することや、片方のアリルで機能的な組換えが成功するとE2Aの抑制因子であるId3が誘導され、E2Aが組換え部位から解離することによってもう片方のアリルの組換えが抑制されることを明らかにした。さらに染色体領域を可視化する3D-FISHによりTCRβ遺伝子座の伸縮状態を解析したところ、染色体上に離れて存在するV領域とDJ領域は、組換えが起きる段階で接近し、組換えが抑制されると離れること,さらにE2Aを過剰発現させると組換えが抑制される段階でも両領域が接近し、組換えが誘導されることを見出した。染色体のルーヒ.ングに関しては、CTCFや、染色体分配に関わるコヒーシン等の蛋白が関与することが示唆されている。そこでTCRβ遺伝子座におけるこれらの蛋白の結合状態を調べた結果、コヒーシンがE2Aの結合様式とよく相関して、組換えの起きる時期特異的に結合することがわかった。さらに培養細胞を用いてコヒーシンのサブユニットをノックダウンすると、組換えが阻害されることがわかった。そこでコヒーシンのサブユニットSmc3のfloxマウスを、様々な分化段階で欠失可能な各種Creマウスと交配することにより、in vivoでのコヒーシンのT細胞分化と遺伝子再構成における役割を検討している。一方、より高解像度で染色体構造を解析するために、Chromosome Conformation Capture(3C)アッセイを立ち上げ解析したところ、V領域は組換えが起きる段階でDJ領域と接近し、間に存在するトリプシノゲン遺伝子とは接近しないことから、染色体ルーピングが起きていると考えられた。この3Cアッセイにより、E2Aの過剰発現が染色体ルーピングを誘導できるかさらに検討している。
2: おおむね順調に進展している
E2Aによる染色体ルーピングを媒介する分子機構の解析において、コヒーシンが、E2Aの結合様式とよく相関して、組換えの起きる時期特異的にTCRβ遺伝子に結合することを見出すことができた。さらに培養細胞を用いてコヒーシンのサブユニットをノックダウンすると、組換えが阻害されたことから、さらにin vivoでのコヒーシンのT細胞分化と遺伝子再構成における役割を明らかにするために、コヒーシンのサブユニットSmc3のfloxマウスを、様々な分化段階で欠失可能な各種Creマウスと交配している。
染色体構造をより高解像度で解析するために、Chromosome Conformation Capture(3C)アッセイを立ち上げ解析したところ、V領域が組換えの起きる時期特異的に染色体ルーピングにより、DJ領域と接近することを見出した。現在、E2Aの過剰発現が染色体ルーピングを誘導できるかこの方法によりさらに検討しているが、この3Cアッセイには、比較的多数の細胞が必要なため、新たに胸腺細胞特異的E2Aトランスジェニックマウスを作製し、解析を行なっている。
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