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2023 年度 実績報告書

迅速二液混合法とポンププローブ法を用いたシトクロム酸化酵素の未知中間体構造の解明

公募研究

研究領域高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用
研究課題/領域番号 22H04746
研究機関岐阜大学

研究代表者

島田 敦広  岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (80723874)

研究期間 (年度) 2022-04-01 – 2024-03-31
キーワードX線自由電子レーザー / ポンププローブ実験 / 膜タンパク質 / 金属タンパク質 / プロトンポンプ / 生体エネルギー
研究実績の概要

本研究課題では酸化的リン酸化の中枢を担うシトクロム酸化酵素(CcO)の反応機構を解本研究課題では酸化的リン酸化の中枢を担うシトクロム酸化酵素(CcO)の反応機構を解明することを目的としている。そのために、CcOの反応中間体のX線回折(XRD)とX線発光分光(XES)を同時に測定することで、これら中間体の化学構造(構成原子の空間座標と電子状態)の酵素反応に伴う変化を追跡する必要がある。そこで、高輝度極短パルスという特徴を持つX線自由電子レーザー(XFEL)によるポンププローブ時分割実験を行うという発想に至った。2023年度の研究では、以下の成果が得られた。
1.微結晶を連続でXFEL照射位置へ移送する方法(SFX法)に適したCcO微結晶の調製法の改良に成功した。2022年度にCcOの高品質な微結晶の調製に成功し、分解能が2.5 オングスロトームの回折データを得ることができた。しかしロット間の格子定数がばらついており、データ処理が難しいという問題があった。そこで、CcOの精製と結晶化時の温度管理や試薬のロット管理を厳密に行うことで、微結晶のロット間での結晶格子のばらつきを抑制することに成功した。これによって従来よりも少ないデータ量で電子密度マップの計算を行うことが出来、1データセットあたり短時間でのデータ収集が可能となった。
2.CO結合還元型CcO微結晶を用いたポンププローブ時分割実験の実施。CO飽和還元剤を調製し、暗幕で覆われた低温嫌気作業ボックス内でCcO微結晶と混合することでCO結合還元型CcO微結晶の調製を試みた。調製したCO結合還元型CcO微結晶を用いて、ポンプ光照射100マイクロ秒後にプローブ光(XFEL)が照射されるようにセッティングを行い、ポンプ光照射の有無による構造変化を捉えられるか確認した。その結果、部分的に結合しているCOの解離が確認された。

現在までの達成度 (段落)

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2023

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (7件)

  • [雑誌論文] Crystallographic cyanide-probing for cytochrome c oxidase reveals structural bases suggesting that a putative proton transfer H-pathway pumps protons2023

    • 著者名/発表者名
      Shimada Atsuhiro、Baba Jumpei、Nagao Shuhei、Shinzawa-Itoh Kyoko、Yamashita Eiki、Muramoto Kazumasa、Tsukihara Tomitake、Yoshikawa Shinya
    • 雑誌名

      Journal of Biological Chemistry

      巻: 299 ページ: 105277~105277

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2023.105277

    • 査読あり
  • [学会発表] 呼吸鎖末端酵素とシアン化物イオンの複合体構造から示唆されるプロトンポンプ機構2023

    • 著者名/発表者名
      島田敦広、村本和優、伊藤-新澤恭子、月原冨武、吉川信也
    • 学会等名
      第49回生体分子科学討論会
  • [学会発表] ウシ心筋由来シトクロム酸化酵素における金属中心の酸化状態変化によって駆動されるプロトン輸送機構の解明2023

    • 著者名/発表者名
      島田敦広、村本和優、伊藤-新澤恭子、月原冨武、吉川信也
    • 学会等名
      第23回日本蛋白質科学会年会
  • [学会発表] シトクロムc-シトクロム酸化酵素複合体の結晶および非結晶構造から予測される電子伝達機構2023

    • 著者名/発表者名
      島田敦広
    • 学会等名
      日本結晶学会年会
  • [学会発表] シトクロムcから呼吸鎖末端酵素への電子伝達機構解明の試み2023

    • 著者名/発表者名
      禹昇完、香西大輔、内藤春菜、西川幸希、藤吉好則、石森浩一郎、谷一寿、島田敦広
    • 学会等名
      第49回生体分子科学討論会
  • [学会発表] Analysis of the electronic state of the metal sites of cytochrome c oxidase using simultaneous XES and XRD measurements2023

    • 著者名/発表者名
      Keigo Tsuiki, Takahumi Kamei, Takanori Nakane, Tetsuo Katayama, Atsuhiro Shimada
    • 学会等名
      第61回日本生物物理学会年会
  • [学会発表] Electron transfer mechanism proposed by the cryo-EM structure of cytochrome c and cytochrome c oxidase complex2023

    • 著者名/発表者名
      Yuto Taguchi,Daisuke Kozai, Haruna Naitou, Kouki Nishikawa, Yohnori Huziyoshi, Kazutoshi Tani, Kouichirou Ishimori, Atsuhiro Shimada
    • 学会等名
      第61回日本生物物理学会年会
  • [学会発表] Guanidine/Biguanide 系薬剤とミトコンドリア呼吸鎖末端酵素の相互作用解析2023

    • 著者名/発表者名
      Seungwan Woo, Gerald I Shulman, Atsuhiro Shimada
    • 学会等名
      第61回日本生物物理学会年会

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公開日: 2024-12-25  

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