• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2022 年度 実績報告書

3次元モダリティー解析法による配偶戦略の性差を生み出す分子神経基盤の解明

公募研究

研究領域神経回路センサスに基づく適応機能の構築と遷移バイオメカニズム
研究課題/領域番号 22H05483
研究機関東北大学

研究代表者

竹内 秀明  東北大学, 生命科学研究科, 教授 (00376534)

研究期間 (年度) 2022-06-16 – 2024-03-31
キーワード最初期遺伝子
研究実績の概要

2022年度はメダカの終脳と視蓋のオスとメスの両方のサンプルを用いて実験を行い、細胞分離過程のストレスで最初期遺伝子の発現が誘導されない条件で、メダカ脳のscRNA-seqの実施に成功した。方法は摘出したメダカ終脳を低温条件下のプロテアーゼ(真菌由来のプロテアーゼ)処理後、物理的な攪拌(先の開いたチップによるピペッテング)により1細胞レベルに分離した(細胞生存率80%以上)。分離した細胞を10X Genomics Chromiumにより、分取、バーコーディング、ライブラリー作製を行った。そして次世代シークエンサーを用いて3’部分配列のシーケンス(バーコード26塩基+125塩基)を行った。結果はメス・終脳(7,383細胞)、メス・視蓋(5,346細胞)、オス・終脳(7,078細胞)、オス・視蓋(8,597細胞)を回収し、そのトランスクリプトームデータを得ることに成功した。また1細胞あたりのリード数は41,694リード/cell(メス・終脳)、57,513リード/cell(メス・視蓋)、47,769リード/cell(オス・終脳)、41,766リード/cell(オス・視蓋)、1細胞あたりの遺伝子数805(メス・終脳)、484(メス・視蓋)、832(オス・終脳)、646(オス・視蓋)、1細胞あたりの
UMIは1,608(メス・終脳)、1,074(メス・視蓋)、1,744(オス・終脳)、1,542(オス・視蓋)UMI/cellのリファレンスデータを取得できた。1細胞あたりの遺伝子数が少ないのは、メダカゲノムデータベースを確認したところ、3’部分配列(polyA付近)が遺伝子モデルに含まれないケースが(3割程度)多いことがわかり、2023年度はゲノムデータベースの整備も必要になることがわかった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

シングルセルトランスクリプトームを用いた実験は順調に進んでいる。一方で、最初期遺伝子(c-fos, egr-1 )のプロモーターとTet-ONシステムを用いて、全脳において1細胞レベルで賦活化ニューロンをGFPラベルできる遺伝子改変メダカの確立が遅れている。c-fos, egr-1プロモーター依存に神経興奮依存のrtTAの転写誘導が確認できたが、翻訳レベルでの発現誘導ができなかった。そこでコンストラクトを作成しなおし、Tet-OFFで動く遺伝子改変メダカを作成しなおした。

今後の研究の推進方策

2023年度は行動実験及び癲癇誘導剤添加実験を実施する。「行動実験→解剖→細胞分離→メタノール保存」を実施し、Chromium(10x Genomics 社)が設置された大阪大学または基礎生物学研究所で「RNA-seqライブラリー作成」を実施する予定である。神経組織を細胞分離した状態でメタノール保存(6週間以内)をしてもscRNA-seqの結果に大きな影響を与えないという報告(BMC Genomics 22: 420, 2021)をもとに、本研究ではメタノール保存した細胞でscRNA-seqを実施するプロトコルを確立する。メタノール保存したサンプルを用いたscRNA-seqがうまくいかない場合は、凍結脳組織を用いた単一核-RNA-seqを実施する。脳の凍結組織(ゼブラフィッシュ)から単一核-を分離するキットは市販で販売されている。この場合は、東北大学で「行動実験→脳解剖→液体窒素保存」を実施し、基礎生物学研究所で「単一核分離」「RNA-seqライブラリー作成」を実施する。メダカc-fos 遺伝子のイントロン部分をプローブにして in situ hybridization法を実施すると賦活化したニューロンの核だけが染色されることを既に確認している。またTet-ONシステムではなく、Tet-OFFを用いた遺伝子改変メダカを用いて、全脳において1細胞レベルで賦活化ニューロンをGFPラベルできるか確認する。

  • 研究成果

    (8件)

すべて 2023 2022 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件) 図書 (1件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] Emory University(米国)

    • 国名
      米国
    • 外国機関名
      Emory University
  • [雑誌論文] Mating experiences with the same partner enhanced mating activities of naive male medaka fish.2022

    • 著者名/発表者名
      Masahiro Daimon, Takafumi Katsumura, Hirotaka Sakamoto, Satoshi Ansai, Hideaki Takeuchi
    • 雑誌名

      Scientific reports

      巻: 12 ページ: 19665-19665

    • DOI

      10.1038/s41598-022-23871-w

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Quantifying Social Interactions in Medaka Fish,2022

    • 著者名/発表者名
      Saori Yokoi, Yasuko Isoe, Mu Yun Wang, Masahiro Daimon, Teruhiro Okuyama, Hideaki Takeuchi
    • 雑誌名

      Behavioral Neurogenetics. Neuromethods

      巻: 181 ページ: 93-105

    • DOI

      10.1007/978-1-0716-2321-3_7

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Perspectives on the Function of Oxytocin in Fish and Mammals2022

    • 著者名/発表者名
      Saori Yokoi , Larry J Young, Hideaki Takeuchi H
    • 雑誌名

      Spectrum of Sex. Springer, Singapore.

      巻: 1 ページ: 135-150

    • DOI

      10.1007/978-981-19-5359-0_8

    • 国際共著
  • [学会発表] Exploring the neural geography of the social brain using medaka fish (Plenary)2022

    • 著者名/発表者名
      Hideaki Takeuchi
    • 学会等名
      The International Conference for Neuroethology (Lisbon)
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] Exploring the neural geography of the fish social brain2022

    • 著者名/発表者名
      Hideaki Takeuchi
    • 学会等名
      第38回 国際生物学賞記念シンポジウム
    • 国際学会 / 招待講演
  • [図書] カラー版 脳とホルモンの行動学 わかりやすい行動神経内分泌学 第2版2023

    • 著者名/発表者名
      近藤保彦 他
    • 総ページ数
      364
    • 出版者
      西村書店
    • ISBN
      4867060437
  • [備考] 東北大学大学院生命科学研究科脳生命統御学専攻 分子行動分野

    • URL

      Perspectives on the Function of Oxytocin in Fish and Mammals

URL: 

公開日: 2023-12-25  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi