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本研究の目的は、メゾ複雑体を構成するタンパク質群のモル比を計測するために、超高感度な絶対定量プロテオミクス技術を構築することである。構築する技術は、代表者が有する独自1細胞プロテオミクス技術を基盤とする。当該技術を確立することで、タンパク質群のモル比(ストイキオメトリー)を計測することが可能となり、細胞内分子動態の構造を観察することにつながる。また、これらの情報を取得することで分子生物学研究への展開だけでなく構造解析や蛍光イメージングによる細胞内動態解析などにも発展することが可能となる。
本年度は、感度とスループットの改良を行った。Isobaricな安定同位体標識試薬を用いることで、複数のサンプルを混合して1度にLC-MS/MSで計測した。また、異なる安定同位体試薬で標識された同一合成ペプチドについて、それぞれ異なる量を1細胞試料に添加することで全てのLC-MS/MSで内部標準の検量線を作成して定量した。LC-MS/MSでは、従来のdata dependent acquisitionモードではなく、parallel reaction monitoringモードで計測することで、検出感度が100倍程度向上し、定量下限値は1 amolだった。アプリケーションとして、30個の1細胞についてCOP9 signalosomeを構成する8種類のタンパク質について絶対定量値を計測した。その結果、構成因子間で絶対量に大きな差が確認された。COPS7以外の構成因子の絶対量は1~10 amolだったのに対して、COPS7AおよびCOPS7Bの量は多い細胞で数10 amolだった。
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