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2011 年度 実績報告書

異常終止コドン認識複合体の構造機能解析

公募研究

研究領域多様性と非対称性を獲得するRNAプログラム
研究課題/領域番号 23112718
研究機関横浜市立大学

研究代表者

山下 暁朗  横浜市立大学, 医学部, 講師 (20405020)

キーワードNMD / mRNA分解 / mRNA代謝 / 翻訳終結
研究概要

クライオ電子顕微鏡法による異常終止コドン認識複合体の立体構造解析
H23年度は、これまでの分子機構研究の課程で明らかとした、「異常終止コドンを識別している分子複合体」の立体構造をクライオ電子顕微鏡法を用いて解析するため、動物細胞からのタンパク質複合体大量精製系の改善を行った。
a)クライオ電子顕微鏡法に用いるタンパク質複合体の精製
これまでの解析により、異常終止コドン識別複合体は、ribosome,eEF2,eRF1,eRF3,Upf1,SMG-1,SMG-8,SMG-9,Upf2,Upf3,エクソンジャンクション複合体、mRNAにより構成されていることを明らかにしている。本研究では、これら構成成分を精製し、試験管内での再構成を試みる。この目的のため、異常終止コドン識別複合体構成分子のうち、SMG-1(430kDa),SMG-8(130kDa),SMG-9(60kDa),Upf1(140kDa),Upf2(165kDa),Upf3b(60kDa)に関し、動物細胞を用いたタンパク質大量精製系を用い精製をおこなった。いくつかの分子については、十分な発現がみられなかったため、動物細胞発現ベクターの改善を行った。具体的には従来のベクターに、翻訳促進配列、mRNA安定化配列を追加し、さらに、人工遺伝子合成によルコドン最適化を行った。これらの改善により、SMG-8について、従来に比べ50倍以上の発現量上昇に成功した。今後他の分子についても、発現量の改善を進めていく。
b)異常終止コドンを識別している分子複合体構成因子の分子間相互作用の解析
Upf2について、eRF3結合領域の同定を進めている。現在までにUpf3bが競合的にUpf2に結合することを明らかとした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

動物細胞高発現ベクターの改良に成功したことにより、蛋白精製に関わるコストを劇的に引き下げることに成功した。これにより当初の計画以上のトライアル実験が可能となった。

今後の研究の推進方策

Cryo-EMによる構造解析が順調に進んでいるため、これに集中する。また、人工遺伝子合成にるコドン最適化により発現量の大幅な上昇が確認できたため、動物細胞を用いたタンパク質大量精製により、結晶構造解析が可能な涼を得ることが可能か解析を行う。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2012 2011 その他

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 5件) 学会発表 (3件) 図書 (2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Heat shock protein 90 regulates phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase family proteins together with the RUVBL1/2 and Tel2-containing co-factor complex2012

    • 著者名/発表者名
      Izumi N, Yamashita A, Hirano H, Ohno S
    • 雑誌名

      Cancer Sci

      巻: 103 ページ: 50-57

    • DOI

      10.1111/j.1349-7006.2011.02112.x

    • 査読あり
  • [雑誌論文] N- and C-terminal Upf1 phosphorylations create binding platforms for SMG-6 and SMG-5:SMG-7 during NMD2012

    • 著者名/発表者名
      Yamashita A, Kutsuzawa K, Izumi N, Hirahara F, Ohno S
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Res

      巻: 40 ページ: 1251-1266

    • DOI

      10.1093/nar/gkr791

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Integrated regulation of PIKK-mediated stress responses by AAA+ proteins RUVBL1 and RUVBL22012

    • 著者名/発表者名
      Izumi N, Yamashita A, Ohno S
    • 雑誌名

      Nucleus

      巻: 3 ページ: 29-43

    • DOI

      10.4161/nucl.18926

    • 査読あり
  • [雑誌論文] A novel role for hSMG-1 in stress granule formation2011

    • 著者名/発表者名
      Brown JA, Roberts TL, Richards R, Woods R, Birrell G, Lim YC, Ohno S, Yamashita A, Abraham RT, Gueven N, Lavin MF
    • 雑誌名

      Mol Cell Biol

      巻: 22 ページ: 4417-4429

    • DOI

      10.1128/MCB.05987-11

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Mutations in POLR3A and POLR3B encoding RNA Polymerase III subunits cause an autosomal-recessive hypomyelinating leukoencephalopathy2011

    • 著者名/発表者名
      Saitsu H, Osaka H, Sasaki M, Takanashi J, Hamada K, Yamashita A, Shibayama H, Shiina M, Kondo Y, Nishiyama K, Tsurusaki Y, Miyake N, Doi H, Ogata K, Inoue K, Matsumoto N
    • 雑誌名

      Am J Hum Genet

      巻: 89 ページ: 644-651

    • DOI

      10.1016/j.ajhg.2011.10.003

    • 査読あり
  • [学会発表] 動物細胞におけるmRNA監視機構の分子機構の研究2011

    • 著者名/発表者名
      山下暁朗
    • 学会等名
      第34回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県)(招待講演)
    • 年月日
      2011-12-15
  • [学会発表] The role of SMG-1 in nonsense-mediated mRNA decay2011

    • 著者名/発表者名
      Yamashita A
    • 学会等名
      RNA Asia Studies
    • 発表場所
      Fullon Hot Spring resort at Tamsui (Taiwan)
    • 年月日
      2011-11-11
  • [学会発表] The SMG-1 mediated N- and C-terminal phosphorylation of Upf1 create binding platform of SMG-6 and the SMG5:SMG-7 complex during nonsense-mediated mRNA decay2011

    • 著者名/発表者名
      Yamashita A, Okada-Katsuhata Y, Kutsuzawa K, Izumi N, Hirahara F, Ohno S
    • 学会等名
      第16回国際RNA学会年会
    • 発表場所
      京都国際会館(京都府)
    • 年月日
      2011-06-17
  • [図書] 横浜医学2012年1月63巻1号2012

    • 著者名/発表者名
      山下暁朗
    • 総ページ数
      16
    • 出版者
      横浜市立大学医学会
  • [図書] 臨床検査2011年9月55巻9号2011

    • 著者名/発表者名
      山下暁朗
    • 総ページ数
      6
    • 出版者
      医学書院
  • [備考]

    • URL

      http://www-user.yokohama-cu.ac.jp/~ohnos/Japanease/indexJ.html

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公開日: 2013-06-26  

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