|
III．アルファスクリーン法によるユビキチン化E3リガーゼの同定および生化学的解析
１）ユビキチン化E3リガーゼの同定：アルファスクリーン法を基盤する申請者らが開発してきた手法を用いて、目的蛋白質タンパク質のユビキチン化反応を検出した。2）新規E3リガーゼによるユビキチン化部位の同定および抗体作成：in vitro系でユビキチン化された基質タンパク質を精製タグで回収後、質量分析によりユビキチン化部位の同定を行った。
IV．細胞がん化における新規分子の細胞生物学的解析
１）共発現による細胞内ユビキチン化確認および細胞内解析：上記で同定されたE3リガーゼ分子のcDNAを基に動物細胞発現用ベクターを構築し、新規分子の細胞内でのユビキチン化および分解促進を確認した。また、ユビキチン化部位の同定、細胞内局在やプロテアソーム阻害剤処理での影響も確認した。2）新規分子の発現抑制におけるがん化維持への影響：抗体を用いて、がん細胞株での新規分子のタンパク質レベルでの発現を確認し、高発現分子にはおいては、siRNAでの発現抑制を行い、増殖や細胞分裂への影響を確認した。
|
