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2011 年度 実績報告書

アクチンフィラメントのB端方向への協同的構造変化とハイパーモバイル水の機能解明

公募研究

研究領域水を主役としたATPエネルギー変換
研究課題/領域番号 23118721
研究機関独立行政法人産業技術総合研究所

研究代表者

上田 太郎  独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 部門付 (90356551)

キーワードアクチンフィラメント / ミオシン / 協同的構造変化 / 運動
研究概要

1.アクチンフィラメントの協同的構造変化の方向性の解明
本研究開始以前に、B端キャッピングタンパク質、アクトS1融合タンパク質、およびピレン標識アクチンをファロイジン存在下で順次重合させることでアクトS1融合タンパク質とピレンアクチンの位置関係を規定したブロック共重合体の作製に成功していた。さらにそうしたブロック共重合体において、アクトS1融合タンパク質がピレンアクチンのB端側にあるときはATP添加によってピレン蛍光が増大するが、アクトS1融合タンパク質がピレンアクチンのP端側にあるときは蛍光強度は変化しないことから、構造変化がP端方向に一方向的に伝播するという予備的な成果を得ていた。しかし前者においてもピレン蛍光の変化幅が小さく、説得力に欠けるきらいがあった。そこで電顕観察を行ったところ、ピレンアクチンのみが重合したホモ重合体が大量に存在することが判明し、これがATP添加に反応しないピレン蛍光の原因であろうと推察された。そこで、ブロック共重合体とピレンアクチンホモ重合体を分離する方法の開発に着手した。
2.アクチンの疎水的ミオシン結合部位はミオシンの運動に必要か?
アクトS1融合タンパク質のホモ重合体はHMM面上で運動できないが、微量のアクチンを混在させると運動能をもったフィラメントが見られるようになることを見出していた。このことは、アクトS1融合タンパク質と正常アクチンは共重合しにくく、共存していても互いに別々のフィラメントを形成しやすいことを示唆する。そこで、アクトS1融合タンパク質だけではなく、他のアクチン融合タンパク質や変異アクチンと正常アクチンを共重合させてみたところ、多くの組み合わせで別々のフィラメントを形成する傾向が認められた。このことは、モノマーアクチンには様々な構造があり、異なる構造のアクチンモノマー同士は共重合しにくいことを示唆する。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

上述のように、現在の実験系では蛍光強度の変化幅が小さいことが問題で、これは、アクトS1融合タンパク質のポリマーにピレンアクチンモノマーを加えてブロック共重合体を作製する際、ピレンアクチンのホモ重合体が大量に生成してしまうためであることが判明している。これは、ピレンアクチンがアクトS1融合タンパク質と共重合しにくいためであると考えられ、このこと自体興味深い現象ではあるが、本測定においては深刻な問題であり、解決が急がれる。

今後の研究の推進方策

ピレン蛍光強度の変化幅を大きくするため、ブロック共重合体とピレンアクチンホモ重合体を分離する必要がある。そのため、アクトS1融合タンパク質にはFLAGタグが付いていること利用し、ガラスに塗布した抗FLAG抗体を使った分離を試みたが、おもわしい結果が得られなかった。そこで、イオン交換樹脂を用いて、電荷の差異に基づく分離ができないか検討する。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2011

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (8件)

  • [雑誌論文] Single restriction enzyme-assisted megaprimer polymerase chain reaction to fuse two DNA sequences on separate cloning vectors2011

    • 著者名/発表者名
      Umeki, N., Uyeda, T.Q.P.
    • 雑誌名

      Anal.Biochem.

      巻: 414 ページ: 309-311

    • DOI

      10.1016/j.ab.2011.03.023

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Stretching actin filaments within cells enhances their affinity for the myosin II motor domain2011

    • 著者名/発表者名
      Uyeda, T.Q.P., Iwadate, Y., Umeki, N., Nagasaki, A., Yumura, S.
    • 雑誌名

      PLoS One

      巻: 6 ページ: e26200

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0026200

    • 査読あり
  • [学会発表] ミオシンHMMとコフィリンのアクチンフィラメントに対する協同的結合は相互排他的である2011

    • 著者名/発表者名
      貴嶋紗久、梅木伸久、中嶋潤、野口太郎、徳楽清孝、上田太郎
    • 学会等名
      第一回日本細胞性粘菌学会
    • 発表場所
      大阪大学(大阪府)
    • 年月日
      2011-11-04
  • [学会発表] Exelusive binding of myosin and cofilin to F-actin2011

    • 著者名/発表者名
      Kijima, S., Noguchi, T., Uyeda, T.Q.P., Tokuraku, K.
    • 学会等名
      日本生物物理学会第49回年会
    • 発表場所
      姫路工業大学(兵庫県)
    • 年月日
      2011-09-18
  • [学会発表] Stretching actin filaments within cells enhances their affinity for the myosin II motordomain2011

    • 著者名/発表者名
      Uyeda, T.Q.P., Iwadate, Y., Umeki, N., Nagasaki, A., Yumura, S.
    • 学会等名
      日本生物物理学会第49回年会
    • 発表場所
      姫路工業大学(兵庫県)
    • 年月日
      2011-09-16
  • [学会発表] Unidirectional conformational changes of actin filaments : possible implications in force generation by myosin2011

    • 著者名/発表者名
      Kien, N.X., Katayama, E., Iwai, S., Suzuki, M., Uyeda, T.Q.P.
    • 学会等名
      日本生物物理学会第49回年会
    • 発表場所
      姫路工業大学(兵庫県)(招待講演)
    • 年月日
      2011-09-16
  • [学会発表] 優性阻害となるAsp11変異アクチンの解析2011

    • 著者名/発表者名
      中嶋潤、梅木伸久、野口太郎、徳楽清孝、長崎晃、上田太郎
    • 学会等名
      2012年生体運動研究合同班会議
    • 発表場所
      筑波大学(茨城県)
    • 年月日
      2011-01-07
  • [学会発表] Acto-cofilin融合蛋白質によって誘導される、アクチンフィラメントの協同的構造変化2011

    • 著者名/発表者名
      梅木伸久、長崎晃、上田太郎
    • 学会等名
      2012年生体運動研究合同班会議
    • 発表場所
      筑波大学(茨城県)
    • 年月日
      2011-01-07
  • [学会発表] ミオシンとコフィリンはF-アクチンに対して排他的に結合する2011

    • 著者名/発表者名
      貴嶋紗久、梅木伸久、上田太郎、徳楽清孝、長崎晃、野口太郎
    • 学会等名
      2012年生体運動研究合同班会議
    • 発表場所
      筑波大学(茨城県)
    • 年月日
      2011-01-07
  • [学会発表] アクチンの生化学的性質へのチロシン143変異の影響2011

    • 著者名/発表者名
      五味渕由貴、上田太郎、若林健之
    • 学会等名
      2012年生体運動研究合同班会議
    • 発表場所
      筑波大学(茨城県)
    • 年月日
      2011-01-07

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公開日: 2013-06-26  

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