| 研究実績の概要 |
PMT活性発現領域(C-PMT)とGαi2ペプチド複合体の結晶化および立体構造の解析
C-PMT変異体並びにGi2αサブユニット(Gαi2)については大腸菌での大量発現系を用いて、アフィニティクロマトで精製することができた。既に結晶構造を決定した変異体（3種類；C1159S, C1165S, C1159SC1165Sダブルミュータント）を用いて、この標的分子のGαi2の認識部分の（20 アミノ酸；IFRMVDVGGQRSERRKWIH並びにその類縁ペプチド）との複合体結晶を数種類作成し、SPring-8において回折データ測定を行った。種々の結晶化スクリーニングの結果、Native 結晶とは結晶化条件や形状並びに空間群など結晶系の異なる数種類の共結晶を得ることができた。構造解析の結果、Gタンパク質の脱アミド化修飾を受けるGln残基のN末端側に存在する2つのGly残基、1つのVal残基がPMTの活性中心付近のクレフト内で相互作用することで、結合に関与していることが明らかになった。
C-PMTとヘテロ三量体GTP結合タンパク質Gαi2の複合体の結晶化
C-PMT並びにGαi2については大腸菌での大量発現系を用いて、アフィニティクロマトで精製した。C-PMT とGαi2との複合体結晶を、数種類の異なる沈殿剤の条件下で作成した。不活型のC-PMT(C1165S並びにC1159SC1165Sダブルミュータント) とGαi2との複合体結晶のスクリーニングについて結晶化を行った。予備的な結晶化条件から、濃縮方法を検討し、C-PMTとGタンパク質複合体の結晶化を行ったところ、リン酸共存下で複合体状態での結晶を確認することに成功した。
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