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本研究の目的は、DNA損傷により停止した転写装置がDNA複製フォークの進行にどのような影響を与えるのかを分子レベルで解明し、転写装置により進行が阻害されたDNA複製がどのようにして回復するのかを明らかにすることである。そのために、申請者らが開発したin vitro oriCプラスミドDNA複製系での複製フォークの進行をモニターする実験系を基盤として、特定の部位にDNA損傷を導入した鋳型DNAを用いることにより損傷部位で停止した大腸菌RNAポリメラーゼによる複製フォークの進行阻害の状況を詳細に解析する。さらに、停止した転写装置を鋳型DNAから排除する働きを持つMfdタンパク質による複製の再開の検証、および遺伝学的な研究から複製フォークの進行と転写の進行をモジュレートすると考えられている一群のDNAヘリカーゼ(DinG、Rep、UvrD)の働きを生化学的に解析する。
本年度は、in vitro oriCプラスミドDNA複製系に用いる特定の部位にＤＮＡ損傷を導入した鋳型ＤＮＡの新規の調製法の確立と、それにより得られた鋳型ＤＮＡを用いた複製フォークの進行の阻害および回復の過程の解析を中心に研究を進めた。DNA損傷としてはベンツピレンがグアニンに付加したものを用い、それを含むオリゴDNAをoriCプラスミドに制限酵素とDNAリガーゼの反応で組み込み、超遠心分離機とゲル電気泳動により精製して、調製法を確立した。oriCプラスミドDNA複製系でリーディング鎖上の損傷により複製フォークが阻害すること、さらにDNAポリメラーゼIVの添加により複製フォークが再開することを生化学的に検出・解析することに成功した。
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