心臓における生体ストレス分子ＴＲＰチャネルの役割

2011 年度 実績報告書

• 研究領域: 統合的多階層生体機能学領域の確立とその応用
• 研究課題/領域番号: 23136505
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 沼田 朋大 京都大学, 地球環境学堂, 助教 (20455223)
• キーワード: TRP / TRPM2 / 心臓 / 虚血再灌流 / 酸化ストレス / イオンチャネル / パッチクランプ / カルシウム

研究概要

本研究課題では、心臓における生体ストレス分子TRPM2チャネルの役割の解明を目指した。TRPM2を強制発現させた細胞を用いて、TRPM2の機能の定量的測定を行った。まず、TRPM2発現HEK293細胞を用いてTRPM2の活性化剤であるADPリボース刺激および過酸化水素刺激に対する活性をパッチクランプ法で定量的な測定を行った。TRPM2の性質を調べる過程で2種類のTRPM2の活性制御に関わる相互作用タンパク質を見つけた。一つ目は、てんかん原因遺伝子EFHC1がTRPM2と相互作用をすることを見つけた。TRPM2は、TRPM2のC末およびN末を介して全体的にEFHC1と相互作用をし、脳、海馬において共局在をすることが分かった。また、カルシウムイメージングおよびパッチクランプ法を用いた機能解析では、過酸化水素およびADPリボースに対するTRPM2の感受性を増強することが酸化ストレス条件下において細胞死を増大させることが分かった(Katano et al. Cell Calcium 2012)。二つ目は、リンパ球の増殖に関与するCD38が相互作用することを見つけた。CD38の相互作用は、高浸透圧刺激でTRPM2と協働することにより活性化し、細胞増殖に関わることを報告した(Numata et al. J Physiol. 2012)。これらの相互作用タンパク質は、心臓にも発現が認められるために心臓において虚血再灌流時の酸化ストレスが大量に産生される病態時においても浸透圧変化のような生理的条件においてもTRPM2が心機能に関与している可能性を示した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

I.単離心筋細胞におけるTRPM2の発現確認と定量的測定によるデータ取得
・心臓の部位ごとにTRPM2の発現を定量的に解析するためにリアルタイムPCR法を用いてmRNA量を、ウェスタンブロット法を用いてタンパク量の評価を行なった。
・1.と同様に心臓の部位ごとで、パッチクランプ法を用いて電流密度を求めた。この際、TRPM2チャネルの活性化には、TRPM2の活性化剤であるADPリボースを用いて検討を行なった。その結果、心房筋細胞においては、TRPM2様の直線的なIV曲線を示す電流が記録された。
II.発現系におけるTRPM2の定量的測定によるデータ取得
・シミュレーションで用いるためのデータとしてTRPM2チャネルそのものの性質を知るためには、動物細胞を用いた発現系で定量的測定を行うことが必要と考え、発現系でパッチクランプ法を用いて検討を行った。TRPM2チャネルの活性の評価を行なう過程で、2種類のTRPM2の活性制御に関わる相互作用タンパク質を見つけた。一つ目は、てんかん原因遺伝子EFHC1がTRPM2と相互作用をすることを見つけた。EFHC1がTRPM2んい相互作用をすることで、酸化ストレスに対するTRPM2の感受性を増強し、細胞死を増大させることが分かった(Katano et al. Cell Calcium 2012)。二つ目は、リンパ球の増殖に関与するCD38が相互作用することを見つけた。CD38の相互作用は、高浸透圧刺激でTRPM2と協働することにより活性化し、細胞増殖に関わることを報告した(Numata et al. J Physiol. 2012)。これらの相互作用タンパク質は、心臓にも発現が認められるために心臓において虚血再灌流時の酸化ストレスが大量に産生される病態時においても浸透圧変化のような生理的条件においてもTRPM2が心機能に関与している可能性を示した。

今後の研究の推進方策

今後、ランゲルドルフシステムを用いて、心臓における虚血、再灌流実験を行ない、この際の変化を野生型マウスおよびTRPM2欠損マウスを用いて比較し、TRPM2の役割を見出す。また、単離心筋細胞でTRPM2の正常時、虚血、再灌流時における役割についてもパッチクランプ法を用いて、検討を行なう。

研究成果

• [雑誌論文] The ΔC splice-variant of TRPM2 is the hypertonicity-induced cation channel in HeLa cells, and the ecto-enzyme CD38 mediates its activation. (2012)
  • 著者名/発表者名: Numata T, Sato K, Christmann J, Marx R, Mori Y, Okada Y, Wehner F
  • 雑誌名: J. Physiol. (London) 巻: 590 ページ: 1121-1138
  • DOI: 10.1113/jphysiol.2011.220947.
  • 査読あり
• [雑誌論文] The juvenile myoclonic epilepsy-related protein EFHC1 interacts with the redox-sensitive TRPM2 channel linked to cell death. (2012)
  • 著者名/発表者名: Katano M, Numata T, Aguan K, Hara Y, Kiyonaka S, Yamamoto S, Miki T, Sawamura S, Suzuki T, Yamakawa K, Mori Y
  • 雑誌名: Cell Calcium 巻: 51 ページ: 179-185
  • DOI: 10.1016/j.ceca.2011.12.011.
  • 査読あり
• [雑誌論文] V2 Receptor-Mediated Autocrine Role of Somatodendritic Release of AVP in Rat Vasopressin Neurons Under Hypo-Osmotic Conditions. (2011)
  • 著者名/発表者名: Sato K, Numata T, Saito T, Ueta Y, Okada Y.
  • 雑誌名: Sci Signal 巻: 4 ページ: ra5
  • DOI: 10.1126/scisignal.2001279.
  • 査読あり
• [雑誌論文] TRPA1 underlies a sensing mechanism for O(2). (2011)
  • 著者名/発表者名: Takahashi N, Kuwaki T, Kiyonaka S, Numata T, Kozai D, Mizuno Y, Yamamoto S, Naito S, Knevels E, Carmeliet P, Oga T, Kaneko S, Suga S, Nokami T, Yoshida J, Mori Y.
  • 雑誌名: Nat Chem Biol. 巻: 7 ページ: 701-711
  • DOI: 10.1038/nchembio.640.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression of N-type calcium channels in human adrenocortical cells and their contribution to corticosteroid synthesis. (2011)
  • 著者名/発表者名: Aritomi S, Wagatsuma H, Numata T, Uriu Y, Nogi Y, Mitsui A, Konda T, Mori Y, Yoshimura M.
  • 雑誌名: Hypertention Research. 巻: 34 ページ: 193-201
  • DOI: 10.1038/hr.2010.191
  • 査読あり
• [学会発表] TRPA1 チャネルの酸素感受機構の解明 (2012)
  • 著者名/発表者名: 沼田 朋大、高橋 重成、清中 茂樹、香西 大輔、森 泰生
  • 学会等名: 第89回日本生理学会大会
  • 発表場所: 長野県松本文化会館
  • 年月日: 20120329-20120331
• [学会発表] 酸感受性外向整流性クロライドチャネル分子実体の探究 (2012)
  • 著者名/発表者名: 佐藤 かお理、沼田 朋大、リー エルバート、岡田 泰伸
  • 学会等名: 第89回日本生理学会大会
  • 発表場所: 長野県松本文化会館
  • 年月日: 20120329-20120331
• [学会発表] 熱性けいれん患者において発見されたHCN2 変異は温度依存的な活性を変化させる (2012)
  • 著者名/発表者名: 中村 友紀、石 秀玉、沼田 朋大、森 泰生、井上 隆司、廣瀬 伸一
  • 学会等名: 第89回日本生理学会大会
  • 発表場所: 長野県松本文化会館
  • 年月日: 20120329-20120331
• [学会発表] Ca2＋チャネル点変異マウスtottering の海馬における癲癇様オシレーションの発生機序解明 (2012)
  • 著者名/発表者名: 中尾 章人、三木 崇史、下野 健、沼田 朋大、清中 茂樹、若森 実、森 泰生
  • 学会等名: 第89回日本生理学会大会
  • 発表場所: 長野県松本文化会館
  • 年月日: 20120329-20120331
• [学会発表] TRPA1は体内への酸素供給を制御する酸素センサーである (2012)
  • 著者名/発表者名: 高橋 重成、桑木 共之、清中 茂樹、沼田 朋大、森 泰生
  • 学会等名: 第89回日本生理学会大会
  • 発表場所: 長野県松本文化会館
  • 年月日: 20120329-20120331
• [学会発表] The juvenile myoclonic epilepsy-related protein EFHC1 interacts with the redox-sensitive TRPM2 channel linked to cell death (2012)
  • 著者名/発表者名: Tomohiro Numata
  • 学会等名: 第一回多階層生体機能学 HD Physiology 国際シンポジウム
  • 発表場所: 東京大学武田先端知ビル武田ホール
  • 年月日: 20120120-20120121
• [学会発表] TRPM7 is an essential regulator for the volume-sensitive outwardly rectifying anion channel (VSOR) activity. (2011)
  • 著者名/発表者名: Tomohiro Numata, Kaori Sato, Carsten Schmitz, Meredith C. Hermosura, Anne-Laure Perraud, Yasuo Mori, Yasunobu Okada
  • 学会等名: The 7th Congress of the Federation of Asian and Oceanian Physiological Societies (FAOPS)
  • 発表場所: Taipei（Taiwan）
  • 年月日: 20110911-20110914
• [図書] トランスポトソームの世界-膜輸送研究の源流から未来へ (2-4-1 総論) (2011)
  • 著者名/発表者名: 森泰生, 沼田朋大, 高橋重成
  • 総ページ数: 471
  • 出版者: 京都廣川書店
• [図書] トランスポトソームの世界-膜輸送研究の源流から未来へ (2-4-2 TRPチャネル) (2011)
  • 著者名/発表者名: 沼田朋大
  • 総ページ数: 471
  • 出版者: 京都廣川書店
• [図書] Activation of TRP channels in mammalian systems. (2011)
  • 著者名/発表者名: Numata, T., Kiyonaka S, Kato K, Takahashi N, & Mori Y.
  • 総ページ数: 499
  • 出版者: Taylor & Francis Group
• [備考] 「トリップ」で「ハイパー」を感じる仕組みを解明
  • URL: http://www.nips.ac.jp/contents/release/entry/2012/02/post-205.html
• [備考] 新たな生体内酸素センサー機構の発見
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news_data/h/h1/news6/2011/110829_1.htm
• [備考] 京都大学 森研究室
  • URL: http://www.sbchem.kyoto-u.ac.jp/mori-lab/index.html